组蛋白乳酸化促进的ALKBH3通过SP100A的m1A去甲基化促进肿瘤进展

尽管N1-甲基腺苷（m1A）RNA修饰是RNA代谢的重要调节因子，但m1A修饰在癌变过程中的作用仍然是一个谜。在此，作者发现组蛋白乳酸化通过去除SP100A的m1A甲基化，增强ALKBH3的表达，同时减弱肿瘤抑制的早幼粒细胞白血病蛋白（PML）缩合物的形成，促进癌症的恶性转化。首先，ALKBH3在高危眼部黑色素瘤中由于组蛋白乳酰化水平过度而特异性上调，指的是m1A的低甲基化状态。此外，多组学分析随后发现，SP100A，PML小体的核心成分，可作为ALKBH3的下游候选靶点。在治疗上，ALKBH3的沉默在黑色素瘤的体内外均显示出有效的治疗效果，这可以通过消耗SP100A来逆转。在机制上，作者发现YTHDF1负责识别m1A甲基化的SP100A转录本，从而增加其RNA的稳定性和翻译效力。总之，作者最初证明了m1A修饰对于肿瘤抑制基因的表达是必要的，这扩大了目前对m1A在肿瘤进展过程中的动态功能的理解。此外，作者的研究结果表明，乳酸化驱动的ALKBH3对于PML核凝聚物的形成是至关重要的，这连接了作者对m1A修饰、代谢重编程和相分离事件的认识。该研究于2023年12月发表在《Nucleic Acids Research》，IF：14.9。

技术路线：

主要研究结果：

1 ALKBH3在眼部黑色素瘤中特异性增加并与不良后果相关

为确定m1A修饰在眼部黑色素瘤发病机制中的作用，作者首先比较了眼部黑色素瘤样本（3个CoM样本和3个UM样本）和4个对照痣样本之间的整体m1A修饰水平。值得注意的是，抗m1A斑点印迹试验显示，眼部黑色素瘤样本的m1A水平显著降低（图1A和B）。此外，去甲基化酶ALKBH3在肿瘤中蛋白表达增加（图1C-E），这与眼部黑色素瘤中m1A水平下降的结果一致。此外，ALKBH3升高与不良预后相关（图1F），进一步强调了ALKBH3在眼部黑色素瘤癌变中的重要性。

同样，在大多数黑色素瘤细胞系（MUM2B、OCM1、OMM2.3、OMM1、MEL290、92.1、92.1、CRMM1、CRMM2、CM2005.1）中，与正常色素细胞（PIG1）相比，m1A水平显著下降（图1G和H）和ALKBH3水平升高（图1I-K）。此外，高通量转录组测序进一步证实ALKBH3在眼部黑色素瘤细胞系中表达上调（图1L）。重要的是，在这些细胞中，ALKBH3与m1A水平呈显著的负相关，这表明ALKBH3的上调是导致m1A水平下降的原因（图1M）。

图1：眼部黑色素瘤显示ALKBH3表达增加，m1A水平降低，这与低生存率相关

2 ALKBH3在体内和体内加速眼部黑色素瘤的发生

为探索ALKBH3的致癌功能，作者使用两个单独的shRNA沉默了ALKBH3的表达（图2A和B）。同样，在ALKBH3缺陷的细胞中，观察到m1A水平显著升高（图2C）。此外，在所有测试的眼部黑色素瘤细胞中，ALKBH3沉默显著减弱细胞生长（图2D）和集落形成能力（图2E和F）。此外，Transwell实验表明，敲除ALKBH3导致迁移能力下降（图2G和H）。这些数据支持ALKBH3作为体外眼部黑色素瘤恶性增殖和转移的必要致癌因子的事实。为评估它们在体内的肿瘤形成能力，作者将对照组和alkbh3沉默的92.1黑色素瘤细胞（荧光素酶标记）注射到裸鼠中，并在原位异种移植模型中监测肿瘤生长。生物发光成像显示，ALKBH3缺陷的眼部黑色素瘤细胞的信号强度弱于对照组细胞（图2I）。此外，在ALKBH3沉默组的异种移植物的平均重量下降了约80%（图2J）。综上所述，这些实验表明，ALKBH3在眼部黑色素瘤的体内外肿瘤发生过程中都起着致癌作用。

图2：ALKBH3基因的下调增加了m1A水平，并抑制眼部黑色素瘤的发生

3 组蛋白乳酸化增强了ALKBH3的过度表达

为确定ALKBH3表达增加的分子基础，作者查询了TCGA数据库，筛选了与ALKBH3共享平行表达模式的基因。根据GO和KEGG分析，作者发现ALKBH3相关基因在几个代谢方面富集，包括氧化磷酸化（P = 1.36e-05）、细胞代谢过程（P = 1.50e-05）和碳水化合物衍生物代谢过程（P = 4.18e-05），表明ALKBH3 RNA表达水平升高可能来自代谢重编程。此外，乳酸生成酶LDHA和LDHB与ALKBH3呈显著正相关，说明ALKBH3与乳酸之间呈显著相关性（图3A和B）。由于先前的研究表明组蛋白乳酸化有助于致癌基因的激活，而眼部黑色素瘤的乳酸化水平有所增加，作者假设ALKBH3水平的增加可能与组蛋白乳酸化有关。

然后，作者在眼部黑色素瘤队列中验证了泛乳酸化和组蛋白乳酸化标记物（H3K18la）之间的表达模式，这与ALKBH3蛋白的表达呈显著的正相关（图3B和C）。更重要的是，H3K18la分析的CUT&Tag和ChIPseq均显示组蛋白乳酸化信号，在ALKBH3的启动子区域捕获（存储在GEO数据库：GSE242019，图3D和E）。此外，组蛋白乳酸化抑制剂（肟酸酯和2-DG）和LDHA/B抑制均导致ALKBH3启动子区组蛋白乳酸化水平显著降低（图3F），这随后去除了所有测试的黑色素瘤细胞中ALKBH3的RNA（图3G）和蛋白水平（图3HJ）。

图3：组蛋白乳酸化增强ALKBH3的表达

4 多组学筛选发现SP100A为ALKBH3的下游候选基因

然后，作者探讨了ALKBH3沉默对眼部黑色素瘤细胞的抑制作用机制。由于ALKBH3负责从RNA中去除m1A修饰，作者首先对眼部黑色素瘤细胞和正常黑素细胞进行m1A-MeRIP-seq（存储在GEO数据库： GSE213748，图4A）。结果表明，从正常细胞和肿瘤细胞生成的m1A-MeRIP-seq文库中，平均鉴定出16 864个和10 212个m1A峰（图4A和B，蓝框）。与之前的m1A-meRIP-seq结果一致，m1A峰在5’UTR中富集，特别是在起始密码子附近。值得注意的是，差异表达的m1A修饰基因与多种黑色素瘤相关通路相关，包括DNA复制、mTOR/AMPK信号通路和黑色素合成，提示m1A修饰在眼部黑色素瘤的发病机制中具有调控作用。

此外，在沉默ALKBH3后，作者进行了一系列全面的高通量筛选，包括m1A-MeRIP-seq（存储在GEO数据库： GSE213748，图4C），RNA-seq（存储在GEO数据库： GSE213681，图4D和E）和对黑色素瘤细胞系的蛋白质组学分析（iTRAQ，图4F）。同样，作者注意到m1A修饰位点的变化在肿瘤相关通路中显著富集，包括PI3KAkt信号通路、局灶粘附和蛋白聚糖合成（图4C）。此外，ALKBH3的沉默导致基因表达水平的显著变化，其中有199个上调基因，74个下调基因（图4D和E，保存在GEO数据库： GSE213681）。一致地，观察到蛋白质组水平的显著变化（149个上调蛋白，67个下调蛋白，图4F），进一步强调了ALKBH3在眼部黑色素瘤发病机制中的重要性。

有趣的是，结合这些多组学数据，作者注意到在眼黑色素瘤细胞中沉默ALKBH3后，核自身抗原斑点蛋白100（SP100）的mRNA和蛋白水平均上调，随后m1A修饰水平发生显著变化（图4G-M）。值得注意的是，SP100负责PML核小体的形成，主要在各种癌症类型中作为肿瘤发生的抑制因子，包括黑色素瘤、胶质母细胞瘤、平滑肌肉瘤、乳腺癌和喉癌。这一观察结果与在ALKBH3缺陷细胞中观察到抑制效果的研究结果一致。重要的是，与正常黑素细胞相比，SP100显示眼部黑色素瘤细胞中m1A甲基化降低。有趣的是，在眼部黑色素瘤细胞中，ALKBH3抑制后，m1A修饰水平下降恢复，这可以从m1A-MeRIP-seq（保存在GEO数据库：GSE213748，图4I）和m1A-MeRIP-qPCR（图4J）中得到证明。由于最近研究发现，mRNA的m1A修饰可能增强基因的表达和翻译效果，因此ALKBH3介导的m1A修饰可能对肿瘤抑制因子SP100的表达至关重要。然后，作者验证了在ALKBH3抑制后，SP100在mRNA水平上显著上调，这可以通过RNA-seq（存储在GEO数据库中： GSE213681，图4K）和qPCR（图4L）得到证实。同样，通过iTRAQ和Western blot检测（图4M）显示，SP100在ALKBH3抑制的细胞中蛋白水平也增加。同样，在87例转移性黑色素瘤样本中，ALKBH3与SP100呈显著负相关（保存在GEO数据库中：GSE7553，R=-0.227，P=0.035）。综上所述，这些数据表明ALKBH3可能通过去除m1A修饰来抑制SP100的表达水平。

图4：ALKBH3通过去除m1A修饰来抑制SP100的表达

5 SP100A是眼部黑色素瘤中的肿瘤抑制因子

值得注意的是，在病毒感染反应的背景下，已经发现了四种显著的SP100异构型（即SP100A、SP100B、SP100C和SP100HMG），这促使作者对这些转录本的表达水平进行比较分析。值得一提的是，SP100A展现出最初15个外显子上与SP100B、SP100C和SP100和SP100HMG（1-1562bp）的共性，而最终外显子长度为395bp的差异（补充图S7A）。从眼部黑色素瘤细胞（92.1）和正常黑素细胞（PIG1）中获得的RNAseq数据显示，SP100A中有明显的信号，而SP100A中不包含的外显子中的信号可以忽略不计（图5A）。此外，作者还使用各种引物进行qPCR。这些引物包括一组专门为SP100A设计的基因（称为SP100-P1），以及另一组检测SP100B、SP100C和SP100HMG（称为SP100-P2）的基因。在眼部黑色素瘤细胞和正常色素细胞中观察到SP100A的RNA表达（图5B）。据报道，人乳腺癌细胞系ZR-75-1表达SP100HMG，作者采用ZR-75-1细胞作为阳性对照。重要的是，SP100B/SP100C/SP100HMG仅在ZR- 75-1中检测到，而在其他细胞系中未检测到。此外，这四种亚型在分子量上存在差异。全蛋白印迹显示SP100A在所有检测细胞系中（~72kDa）的特异性蛋白表达，这与之前研究中SP100A的分子量一致。研究结果表明，SP100A在我们的实验背景下大量表达，而其他亚型（SP100B、SP100C和SP100HMG）的表达可以忽略不计。

值得注意的是，与正常色素细胞相比，眼部黑色素瘤细胞中SP100A的RNA表达水平也显著下降，RNA-seq（图5A）、qPscr（图5B）和western blot检测（图5C）显示。为充分揭示SP100A在眼部黑色素瘤中的作用，作者随后检测了SP100A在眼部黑色素瘤临床样本中的表达。值得注意的是，作者发现在眼部黑色素瘤样本中，SP100A显著降低（图5D和E）。更重要的是，在作者的队列（图5F）和TCGA队列（图5G）中，SP100A的缺失与不良结果相关。

此外，根据眼部黑色素瘤样本的单细胞分析（GSE139829，使用CancerSEA平台），SP100表达与肿瘤激活特征得分降低有关，包括侵袭（R=-0.33，P<0.001）、转移（R=-0.28，P<0.001）、细胞周期激活（R=-0.19，P<0.001）、增殖（R=-0.16，P<0.001）和上皮-间充质转化（R=-0.16，P<0.001）。总的来说，这些数据表明SP100A被下调，并可能在眼部黑色素瘤中抑制一些致癌事件。

由于SP100A在眼部黑色素瘤中表达下调，作者在三种眼部黑色素瘤细胞系中外源性过表达SP100A。有趣的是，所有被检测的眼部黑色素瘤细胞在过表达SP100A后均表现出增殖能力的减弱（图5H）。此外，与对照组相比，过表达SP100A的黑色素瘤细胞形成的集落更小、更少（图5I和J）。此外，在眼部黑色素瘤细胞中引入SP100A后，可观察到其对肿瘤转移能力的显著抑制作用（图5K和L）。

最重要的是，由于SP100A作为PML小体内的分子支架，作者随后评估了PML在过表达SP100A细胞中的表达。因此，外源性过表达SP100A导致PML蛋白水平显著升高（图5M）。综上所述，这些数据进一步证实SP100A对PML的表达至关重要，这与之前的研究结果一致。此外，ALKBH3缺陷的细胞在PML小体中表现出显著升高，这与ALKBH3在调节SP100A表达过程中的关键作用相一致。综上所述，这些数据显示，SP100A负责PML核凝聚物的形成，在眼部黑色素瘤中作为肿瘤抑制因子。

图5：SP100A在眼部黑色素瘤中起着肿瘤抑制因子的作用

6 SP100A的沉默部分损害ALKBH3缺陷细胞的肿瘤抑制效果

为进一步验证ALKBH3和SP100A表达之间的关系，作者通过转染已报道的针对SP100A的shRNA，进一步改变ALKBH3抑制后的眼黑色素瘤细胞中SP100A的表达。与预期的一样，在RNA和蛋白水平转染三个眼黑色素瘤细胞后，SP100A的表达显著降低。在细胞生长过程中，SP100A的缺失部分挽救ALKBH3抑制引导下的抑制作用（~50-60%）（图6A），而SP100A缺失的细胞对ALKBH3缺失更具有抵抗力（图6A）。SP100A沉默的细胞比对照组有更多的菌落（图6B）。此外，抑制SP100A显著增强细胞迁移能力，并削弱对ALKBH3缺陷的黑色素瘤细胞的抑制作用（图6C）。最重要的是，SP100A敲除进一步挽救ALKBH3耗竭的黑色素瘤细胞中原位肿瘤的形成（图6D和E）。同样，SP100A的稳定敲低导致野生型（图6F）和ALKBH3缺陷的眼黑色素瘤细胞（图6F）中PML的表达受损。综上所述，这些结果表明，ALKBH3通过减少SP100A介导的PML小体来促进眼部黑色素瘤。

图6：SP100A沉默部分阻断ALKBH3基因下调的抗癌作用

7 SP100A的m1A修饰增强了其RNA的稳定性和翻译效力

然后，作者探讨了SP100A的m1A修饰的表观遗传机制。由于之前的研究表明YTHDF蛋白负责识别m1A甲基化，作者首先用YTHDF1、YTHDF2和YTHDF3检测SP100A mRNA的RNA binding状态。RNA免疫共沉淀分析表明，YTHDF1能特异性识别SP100A mRNA；然而，YTHDF2和YTHDF3只有有限的相互作用强度（图7A）。此外，在TCGA队列中，YTHDF1与SP100A的表达呈显著的正相关（R=0.61，P<0.0001）（图7B），这与YTHDF1是识别SP100A所必需的假设完全一致。此外，YTHDF1沉默显著抑制了SP100A的表达，并完全挽救ALKBH3沉默介导的SP100A水平的升高（图7C和D）。综上所述，YTHDF1是SP100A的解读蛋白。

然后，作者确定SP100A mRNA的特异性m1A修饰位点。在SP100A的5’UTR中，根据鉴定出的峰，作者发现5个潜在的m1A位点（图4I）[c.44A (TGTGG),c.54A（AGACG）和c.67A（TGAGG），和 c.92A/c.93A（GGAAG）]突变为T，然后将相应的野生型和突变的5’UTR克隆到pmirGLO载体中（图7E）。荧光素酶报告基因检测结果表明，c.A92T的信号下降，而其他突变组的信号保持不变（图7E）。此外，作者采用RIP-qPCR来鉴定YTHDF1与报告基因转录本（F-luc）之间的相互作用频率。观察到pmirGLOMUT4 (c.A92T)转录本在YTHDF1和F-Luc之间的结合亲和力降低，而其他转录本保持不变。这一结果与之前观察到的YTHDF1直接与m1A甲基化序列相互作用的结果一致，这被认为是RNA中m1A的“Reader”。此外，作者发现ALKBH3缺失的细胞中SP100A的RNA稳定性增强，这与ALKBH3缺失后SP100A RNA表达的增加相一致（图7F）。重要的是，在92.1细胞中进行的多聚体分析显示，ALKBH3稳定敲除导致多聚体部分的SP100A mRNA丰度显著（图7G），这通常具有有效的翻译能力。这一观察结果与之前的结论一致，即早期外显子中的m1A修饰会导致其翻译能力增强。值得注意的是，在ALKBH3基因敲低后，新生的SP100A RNA表达仍然没有发生改变。综上所述，这些结果表明，SP100A mRNA的m1A RNA甲基化有助于增加RNA的稳定性和转录后的翻译能力。

图7：SP100A的m1A修饰提高其RNA的稳定性和翻译效果

结论：

总之，作者的研究结果揭示了一个全新的肿瘤发生模型，其中m1A修饰的SP100A mRNA促进PML核缩合物的形成。此外，本研究首次揭示m1A负责肿瘤抑制基因的激活，揭示了组蛋白乳酸化、m1A修饰和相分离介导的凝聚物形成之间的串扰，从而提供了一种靶向m1A重编程的有效治疗方法。

实验方法：

细胞体外培养，斑点印迹实验，免疫荧光，WB，qPCR，质粒构建和转染，细胞增殖实验，细胞克隆实验，Transwell，异种移植物模型，ChIP-seq，CUT&Tag，MeRIP-seq，RNA-seq，RIP-qPCR，荧光素酶报告实验

参考文献：

Gu X, Zhuang A, Yu J, et al. Histone lactylation-boosted ALKBH3 potentiates tumor progression and diminished promyelocytic leukemia protein nuclear condensates by m1A demethylation of SP100A. Nucleic Acids Res. 2024;52(5):2273-2289. doi:10.1093/nar/gkad1193