NSUN2通过增强SKIL mRNA的稳定性促进结直肠癌的进展

         NSUN2是催化m5C形成的重要RNA甲基转移酶之一，参与许多关键的生物过程。然而，NSUN2介导的m5C修饰在结直肠癌(CRC)中的作用和潜在的分子机制尚不清楚。NSUN2在结直肠癌中高表达，与结直肠癌患者生存不良相关。此外，在NSUN2敲除小鼠模型中，沉默NSUN2抑制CRC肿瘤的发生和进展。体外和体内研究表明，NSUN2促进结直肠癌细胞生长。从机制上讲，SKIL受NSUN2的正调控，NSUN2-SKIL轴与结直肠癌有临床相关性。NSUN2诱导SKIL的m5C修饰并稳定其mRNA，该修饰由YBX1介导。升高的SKIL水平增加了TAZ的的激活。我们的研究结果强调了NSUN2通过m5C-YBX1依赖性的SKIL转录物稳定化在CRC的发生和进展中的重要性，为CRC提供了一种有希望的靶向治疗策略。本文于2024年2月发表于“Clin Transl Med”（IF=10.6）上。

技术路线

结果

1）结直肠癌组织中NSUN2的过表达与患者生存和肿瘤发生有关

         为了探索mRNA m5C修饰在CRC中的作用，我们评估了TCGA的CRC队列中主要mRNA m5C甲基转移酶的表达水平(图1A)。NSUN6、NSUN7、TRDMT1在结直肠肿瘤组织与邻近正常组织中的表达无明显差异。有趣的是，NSUN2在肿瘤中的表达水平高于正常组织。这些发现也在不同的CRC数据集中得到了验证，包括GSE20916、GSE33113和GSE8671(图1A)。此外，在新鲜采集的结直肠癌组织中也发现了NSUN2的过表达(图1B、C)。Kaplan-Meier生存分析显示，NSUN2高表达的结直肠癌患者的总生存率(OS)低于NSUN2低表达的结直肠癌患者(图1D)。接下来，我们产生了NSUN2敲除小鼠(NSUN2-/-)来研究NSUN2在CRC中的作用。我们建立了CRC模型(图1E)。正如预期的那样，Nsun2-/-小鼠比Nsun2+/+小鼠产生的肿瘤更小，更少(图1F-H)。组织病理学分析显示，与Nsun2-/小鼠相比，Nsun2+/+小鼠的结直肠肿瘤分期较早(图1I)，表明NSUN2在结直肠癌的致瘤性和进展中起关键作用。

2）NSUN2促进结直肠癌的发生和进展

         为了研究NSUN2对结直肠癌细胞行为的影响，我们用shRNA敲除NSUN2，并通过western blotting测定其效率。通过集落形成实验探讨NSUN2对结直肠癌细胞增殖的调控作用。如图2A和B所示，NSUN2的缺失抑制了细胞增殖，而过表达NSUN2则表现出相反的效果。此外，重新引入NSUN2可以挽救CRC细胞的生长(图2C)。集落形成实验显示，NSUN2促进了集落形成能力(图2D-F)。我们还发现，NSUN2敲低后，迁移细胞的数量显著减少(图2G)。相反，上调NSUN2可增加细胞迁移能力(图2H)。拯救实验表明，NSUN2参与促进CRC细胞的迁移，进一步证实了NSUN2的致瘤作用(图2I)。将稳定感染的DLD1细胞接种于裸鼠侧翼，观察NSUN2对异种移植瘤生长的影响。与对照组相比，NSUN2敲低组肿瘤的大小和重量明显减小，这可以通过重新引入NSUN2来挽救(图2J-L)。总的来说，这些结果表明NSUN2在体内和体外都能促进结直肠癌的生长。

3）NSUN2刺激CRC中SKILL的表达

         在NSUN2敲低或过表达的CRC细胞中，免疫荧光检测显示m5C荧光信号与NSUN2的表达呈显著正相关(图3A, B)，表明NSUN2对CRC细胞中m5C的修饰水平起作用。因此，为了确定参与NSUN2介导的CRC进展的下游效应物，我们使用RNA测序和亚硫酸盐测序(RNA-bisseq)数据评估了潜在靶点。重叠后，有14个潜在目标(图3C)。其中，ATF3、CDK9、HEY1、CBX4、ITGB1、SKIL为癌基因，而SETD2作为肿瘤抑制基因。然而，当我们使用不同的细胞系进行验证时，在DLD1细胞、HCT116细胞和HT-29细胞中，NSUN2敲低后，只有SKIL表达水平持续降低(图3D)。NSUN2缺失显著降低了SKIL mRNA和蛋白水平，而NSUN2过表达产生相反的结果(图3D和)。Nsun2+/+小鼠的SKIL表达水平高于Nsun2-/-小鼠(图3E)。生物信息学分析显示，CRC中SKIL表达上调(图3F)。临床上，SKIL表达水平高的患者预后较差(图3G)。为了进一步评估NSUN2和SKIL之间的临床相关性，我们检测了它们在一组结直肠癌组织中的表达谱。结果显示，NSUN2高表达的肿瘤组织具有较高的SKIL水平(图3H, I)。此外，我们对组织微阵列(TMA)进行了免疫组化染色。NUSN2与SKIL在临床表现为显著正相关(图3J、K)。

4）NSUN2通过SKIL促进CRC细胞的恶性表型

         为了揭示NSUN2-SKIL轴的功能，我们设计了拯救实验。SKIL过表达恢复了NSUN2敲低对结直肠癌细胞增殖、集落形成和迁移的抑制作用(图4A-C)。用或不加shNSUN2和PLVX-SKIL处理的DLD1细胞接种于裸鼠侧翼。结果显示，NSUN2敲低抑制肿瘤生长，降低肿瘤重量和Ki67表达水平，而SKIL过表达恢复了这些作用(图4D-G)。总之，SKIL是NSUN2促进结直肠癌恶性的关键靶点。 

5）NSUN2甲基化以YBX1依赖的方式稳定SKIL mRNA

         接下来，我们探讨了NSUN2的致癌功能是否取决于其m5C甲基转移酶活性。通过在NSUN2沉默细胞中过表达NSUN2野生型(WT)和突变型质粒，我们发现只有野生型能够挽救CRC细胞的增殖和集落形成，而酶促死亡的NSUN2突变体则不起作用(图5A)。此外，过表达WT而非突变型NSUN2在NSUN2敲除细胞中恢复了SKIL mRNA和蛋白质水平(图5B)。接下来，我们发现m5C抗体可以有效地富集SKIL mRNA(图5C)。此外，沉默NSUN2降低了CRC细胞中SKIL的m5C水平，这可以通过过表达WT而不是突变的NSUN2来挽救(图5D)。由于m5C修饰可以调节靶mRNA的稳定性，为了确定NSUN2介导的m5C如何调节SKIL mRNA的表达，我们用放线菌素D处理CRC细胞。如图5E所示，NSUN2沉默显著降低了SKIL mRNA的半衰期。这种减少可以通过过表达野生型而非突变型NSUN2来恢复(图5F)，这表明NSUN2通过m5C修饰增强其mRNA的稳定性来上调SKIL。

         YBX1是一种重要的m5C读取器，已被证明通过招募ELAVL1维持mRNA稳定性。RIP实验显示YBX1可以与SKIL mRNA结合(图5G)，并且这种相互作用在NSUN2沉默的细胞中减少(图5H)，表明YBX1可能是SKIL的m5C读取器。进一步研究表明，shYBX1可通过降低CRC细胞中SKIL mRNA的稳定性来降低SKIL的表达水平(图5I, J)。沉默YBX1可抑制NSUN2对SKIL表达的激活(图5K, L)。综合上述结果，我们得出结论，NSUN2可通过增加CRC细胞中SKIL mRNA的稳定性，以依赖于YBX1的方式上调SKIL的表达。

6）NSUN2诱导SKIL-TAZ轴促进结直肠癌肿瘤发生

         YAP/TAZ是密切相关的转录调控因子，参与不同类型癌症的进展。我们试图确定NSUN2是否影响SKIL-TAZ轴。如图6A, B所示，NSUN2过表达增加了TAZ蛋白水平，而NSUN2敲低抑制了TAZ蛋白的表达。进一步的实验表明，NSUN2沉默可显著抑制结直肠癌细胞中TAZ靶基因的表达(图6C)。NSUN2敲低增加了TAZ蛋白的周转率(图6D)。此外，SKIL过表达部分恢复了NSUN2缺失细胞中TAZ表达及其靶点的激活，表明NSUN2调节了SKIL-TAZ轴(图6E, F)。随后，我们试图在患者来源的异种移植(PDX)模型中确定NSUN2介导的TAZ调节的临床相关性。为此，在测量了NSUN2的表达水平后(图6G)，我们将从CRC患者中切除的新鲜原发肿瘤样本植入免疫功能低下的小鼠体内，然后腹腔注射PBS或维替泊芬(一种YAP/TAZ-TEAD介导的转录干扰物)(图6H)。值得注意的是，给药维替泊芬可以减缓NSUN2高的PDX肿瘤的进展(病例1和2)。相反，维替泊芬对NSUN2低的PDX肿瘤的生长和体重影响很小(病例3和4;图6I, J)。

结论：

         NSUN2通过促进SKIL mRNA的稳定，进而促进TAZ的激活，从而促进结直肠癌的恶性发展。

实验方法：

         AOM-DSS小鼠模型构建；裸鼠异种移植瘤模型；PDX模型；免疫印迹法；免疫组化；免疫荧光；RT-PCR；细胞增殖和集落形成试验；transwell。

参考文献：

         Zou S, Huang Y, Yang Z, Zhang J, Meng M, Zhang Y, Feng J, Sun R, Li W, Wang W, López JG, Fang L. NSUN2 promotes colorectal cancer progression by enhancing SKIL mRNA stabilization. Clin Transl Med. 2024 Mar;14(3):e1621. doi: 10.1002/ctm2.1621.