LINC01559通过干扰波形蛋白的泛素化促进肺腺癌转移
肺癌是全球最常见的癌症之一，也是癌症相关死亡的主要原因，其中肺腺癌（LUAD）是最常见的肺癌亚型。早期LUAD可通过根治性切除治愈，但晚期LUAD目前尚无根治性治疗方法，尽管近年来分子靶向治疗、免疫治疗和联合治疗取得了进展。这与疾病转移到原发部位以外密切相关。然而，参与肺腺癌转移的分子机制尚不完全清楚，虽然已知上皮-间充质转化（EMT）在驱动转移过程中至关重要，而波形蛋白作为一种中间丝蛋白，在EMT过程中发挥着减少细胞间黏附和重组细胞结构的关键作用，使细胞变得更具有迁移和侵袭性。目前几乎所有的癌症生物标志物和治疗方法都以蛋白质和编码这些蛋白质的基因为靶点。然而，越来越多的人认识到非编码RNA在多种病理生物学过程中发挥着重要作用。特别是lncRNA的失调与癌症的发病机制密切相关。lncRNA常与其他生物分子建立分子间相互作用。这使得lncRNA可以作为拴系、导向、诱饵或支架来承担各种生物学功能，包括癌症的发生、发展和治疗抵抗。值得注意的是，参与肺腺癌发病机制的失调lncRNA列表也在迅速扩展。然而，lncRNA在肺腺癌转移中的作用仍有待完全阐明。该研究发表在《Biomarker Research》，IF：11.1。
技术路线：
主要研究结果：
1、LINC01559高表达与肺腺癌转移及患者不良预后相关
为了更好地了解lncRNA在肺腺癌转移中的作用，作者研究了先前发表的基因表达芯片数据集treatment-naïve非小细胞肺癌（NSCLC），该数据集包含不同病理分期的肺腺癌病例。该分析显示，与无转移病灶的肺腺癌患者相比，5个注释的lncRNA（HAND2-AS1、GLIS3-AS1、MRVI1-AS1、LINC00612和LINC01559）在有转移病灶的肺腺癌患者的支气管镜活检组织中表达水平较高（图1A）。有趣的是，癌症基因组图谱（TCGA）中LUAD数据集的分析显示，LINC01559的高表达与LUAD患者的总生存（OS）相关（图1B），而其他lncRNA的高表达与LUAD患者的OS无关（图1B）。事实上，在TCGA LUAD数据集中，与配对的非癌肺组织相比，LINC01559在LUAD中表达水平升高（图1C）。
通过原位杂交分析，作者证实了LINC01559在90例福尔马林固定石蜡包埋的肺腺癌样本中表达上调（图1D，E）。根据患者性别和诊断时的中位年龄分层的不同组的肺腺癌中，LINC01559的表达没有显著差异。LINC01559高表达与肺腺癌较高的组织学分级（III-IV级）和晚期（美国癌症联合委员会 III-IV期）相关。进一步分析显示，LINC01559高表达与患者较差的OS相关（图1F）。此外，多变量Cox回归分析显示，LINC01559的高表达与OS独立于分期和诊断时的年龄（肺腺癌患者的明确预后标志物）相关。同样，LINC01559在4个肺腺癌细胞系中的3个中的表达水平高于人成纤维细胞系HSF（图1G）。综上所示，LINC01559在肺腺癌中表达上调，尤其是在伴有转移的肺腺癌中，其高表达与肺腺癌患者的不良预后相关。因此，作者着重研究LINC01559在肺腺癌转移中的潜在作用及其相关的分子机制。
图1 LINC01559在有转移的肺腺癌中高表达，与患者不良预后相关
2、LINC01559促进肺腺癌转移
为了功能性地检测LINC01559在肺腺癌转移中的作用，作者使用两个独立的siRNA在A549和H1299细胞中敲低LINC01559（图2A）。事实上，在划痕实验中，siRNA敲低显著延迟了LUAD细胞的伤口愈合，在transwell实验中降低了它们对Matrigel基质胶的迁移和侵袭（图2B-E）。
为了进一步研究，作者建立了A549亚系A549。shRNA稳定敲低LINC01559的shLINC01559（图2F）。此外，NOD/SCID小鼠尾静脉注射A549。与注射携带对照shRNA的A549的细胞相比，shLINC01559细胞的肺转移病灶形成显著减少（图2G，H）。对随机选取的肺结节进行苏木精-伊红（H&E）染色，病理证实肺转移（图2I）。综上所述，这些结果表明LINC01559促进肺腺癌的体内转移。
图2 LINC01559促进肺腺癌转移
3、LINC01559与波形蛋白相互作用
为了了解LINC01559促进肺腺癌转移的机制，作者使用qPCR分析A549和H1299细胞的亚细胞部分来检测其亚细胞定位。该分析表明LINC01559主要定位于LUAD细胞的细胞质（图3A）。值得注意的是，当作者使用RNA pulldown（RPD）和质谱分析与LINC01559相互作用的蛋白时，发现与LINC01559共沉淀的蛋白中含量最多的是波形蛋白（图3B），这是一种主要位于细胞质的中间丝蛋白，与细胞的运动、侵袭和转移密切相关。作者随后在A549和H1299细胞中使用RPD和RNA免疫沉淀实验证实了LINC01559和波形蛋白的关联（图3C，D）。总之，这些结果表明，LINC01559和波形蛋白之间的相互作用可能在LINC01559介导的促肺腺癌细胞转移中发挥作用。
图3 LINC01559与波形蛋白结合
4、波形蛋白在LINC01559介导的肺腺癌细胞迁移和侵袭中发挥重要作用
作者接下来研究了波形蛋白在LINC01559介导的肺腺癌细胞迁移和侵袭中的功能重要性。transwell实验显示，siRNA敲低波形蛋白降低了A549和H1299细胞的侵袭和迁移（图4A-C）。重要的是，进一步的分析表明，波形蛋白过表达阻止了siRNA敲低LINC01559引起的迁移和侵袭的减少，而敲低波形蛋白抑制了LINC01559过表达引起的迁移和侵袭的促进（图4D-F）。因此，波形蛋白是LINC01559促进肺腺癌细胞迁移和侵袭所必需的。
图4 波形蛋白在LINC01559介导的肺腺癌细胞迁移和侵袭中发挥重要作用
5、LINC01559促进波形蛋白表达
为了进一步了解LINC01559与波形蛋白相互作用的意义，作者检测了敲低和未敲低LINC01559的A549和H1299细胞中波形蛋白的表达。有趣的是，虽然siRNA敲低LINC01559并没有引起波形蛋白 mRNA水平的任何显著变化（图5A），但它显著降低了A549和H1299细胞中波形蛋白蛋白的表达（图5B）。相比之下，过表达LINC01559导致波形蛋白蛋白水平的上调（图5C），而波形蛋白 mRNA的表达没有明显变化（图5D）。另一方面，在A549和H1299细胞中，波形蛋白的敲低和过表达都没有触发LINC01559的表达变化（图5E，F）。因此，LINC01559通过转录后增加促进波形蛋白的表达。从A549分离的LUAD细胞具有指导意义。与携带对照shRNA的A549细胞相比，shLINC01559肺转移瘤细胞的波形蛋白表达水平同样较低（图5G），表明LINC01559在体内调节LUAD细胞的波形蛋白表达。
图5 LINC01559促进波形蛋白表达
6、LINC01559通过抑制波形蛋白的泛素化而稳定波形蛋白
在发现LINC01559通过转录后上调促进波形蛋白表达后，作者在敲低或未敲低LINC01559的A549和H1299细胞中进行了放线菌酮追逐实验。事实上，siRNA敲低LINC01559加速了波形蛋白的转换（图6A），表明LINC01559调节了波形蛋白的稳定性。与此同时，蛋白酶体抑制剂MG132的处理减少了siRNA敲低LINC01559引起的波形蛋白的减少（图6B）。由于多聚泛素化是蛋白酶体介导的蛋白降解所必需的，作者测试了LINC01559是否影响波形蛋白的多聚泛素化。事实上，siRNA敲低LINC01559导致A549和H1299细胞中波形蛋白多泛素化增加（图6C）。相比之下，过表达LINC01559导致细胞中波形蛋白的多泛素化降低（图6D）。重要的是，A549来源的LUAD细胞中波形蛋白的多泛素化更强。与来自A549.sh-ctrl肺转移瘤的肿瘤进行比较（图6E）。综上所述，这些结果表明LINC01559通过抑制波形蛋白的多泛素化来促进LUAD细胞中波形蛋白的表达。
图6 LINC01559稳定波形蛋白
结论：
lncRNA LINC01559与波形蛋白结合并阻止其泛素化和蛋白酶体降解，从而促进肺腺癌细胞迁移、侵袭和转移。LINC01559在转移性肺腺癌中表达上调，LINC01559高表达与肺腺癌患者的不良预后相关。这些结果揭示了一个新的lncRNA介导的促进肺腺癌进展的机制，并提示LINC01559的表达可能是肺腺癌患者的独立预后因素，靶向LINC01559可能是治疗晚期肺腺癌的潜在方法。
实验方法
细胞培养，实时荧光定量PCR(qPCR)，伤口愈合试验，Transwell迁移和侵袭实验，原位杂交(ISH)，RNA pull-down，RNA免疫沉淀(RIP)，质谱分析，泛素化分析，小鼠肺腺癌转移模型
参考文献：
Feng H, Xu D, Jiang C, Chen Y, Wang J, Ren Z, Li X, Zhang XD, Cang S. LINC01559 promotes lung adenocarcinoma metastasis by disrupting the ubiquitination of vimentin. Biomark Res. 2024 Feb 5;12(1):19. doi: 10.1186/s40364-024-00571-3. PMID: 38311781; PMCID: PMC10840222.