LINC00887通过提高H3K27cr水平促进结直肠癌转移

最近的观察显示，H3K27cr在结直肠癌（CRC）组织中上调；然而，根本原因仍然难以捉摸。本研究旨在探讨H3K27cr上调的机制及其在CRC转移中的作用。临床上，我们的研究结果表明，H3K27cr是区分结直肠癌组织与健康对照的高度准确的诊断标志物。升高的LINC00887和H3K27cr水平与CRC患者较差的预后相关。在功能上，LINC00887和H3K27cr促进了CRC细胞的迁移和侵袭。机制上，LINC00887与SIRT3蛋白相互作用。LINC00887过表达阻断了GCN5启动子内SIRT3的富集，从而使该区域的H3K27ac水平升高，而H3K27cr水平未升高，进而激活GCN5的表达。这种激活提高了H3K27cr的总体水平，促进了GCN5、H3K27cr和YEATS2在ETS1启动子内的富集，激活了ETS1的转录，最终促进了CRC的转移。体内研究表明，抑制LINC00887可抑制结直肠癌转移，但当小鼠接受NaCr治疗时，这种抑制作用被消除。总之，我们的研究结果证实了H3K27cr在结直肠癌个体中的诊断生物标志物潜力，并提出了一个功能模型来阐明LINC00887通过提高H3K27cr水平参与促进结直肠癌转移。本文于2024年10月发表于“Cell Death and Disease”（IF=8.1）上。

技术路线：

结果：

1）H3K27cr水平高与预后不良相关

我们检测了97名结直肠癌患者癌组织及58名患者癌旁组织中H3K27cr的水平。结果显示，癌组织的H3K27cr水平高于正常组织（图1A-C）。我们研究了H3K27cr在区分结直肠癌组织与健康对照组中的潜在诊断价值。值得注意的是，ROC曲线分析显示曲线下面积（AUC）值为0.9（图1D）。此外，在我们之前的研究队列中重复了这一分析，得到的AUC值为0.81（图1E）。我们还评估了H3K27cr在区分远处转移的结直肠癌患者与无远处转移患者中的诊断价值，得到的AUC值为0.84（图1F）。进一步地，H3K27cr显示出区分转移部位与原发结直肠癌组织的能力，AUC值为0.75（图1G）。特别值得注意的是，在伴有淋巴结侵犯的结直肠癌患者中，H3K27cr水平升高者的预后较差（图1H）。

2）LINC00887提高H3K27cr水平

接下来，我们研究了lncRNAs是否调节H3K27cr修饰。我们从TCGA数据集中识别了结肠腺癌（COAD）中差异表达的基因，或者使用激光显微切割技术获得的结直肠癌患者的上皮细胞中的差异表达基因（GSE15960）。研究发现，在COAD组织和从结直肠癌细胞衍生的上皮细胞中分别有1573和4241个基因差异表达。将这两个结果结合起来，发现了298个差异表达的基因，包括五个lncRNAs（图2A）。使用GSEA分析检查这五个lncRNAs与具有被H3K27cr占据的启动子的基因之间的关联。这些发现表明，具有被H3K27cr占据的启动子的基因在上皮细胞或COAD组织中高表达LINC00887的情况下显著富集（图2B, C）。随后，对来自单细胞转录谱的上皮细胞进行了类似分析。检查了来自GSE110009数据集的总共8083个细胞，识别出15个不同的细胞亚型（图2D）。具有被H3K27cr占据的启动子的基因在上皮细胞和Th0细胞中富集（图2E）。GSEA结果显示，在上皮细胞中高表达LINC00887的情况下，具有被H3K27cr占据的启动子的基因显著富集，但在Th0细胞中则不然（图2F）。接下来，我们通过qRT-PCR检测伴有淋巴结侵犯的结直肠癌患者中LINC00887的表达。结果表明，高LINC00887表达与预后不良显著相关（图2G）。Spearman相关性分析显示LINC00887与H3K27cr水平之间存在正相关关系（图2H）。LINC00887过表达增加了H3K27cr水平（图2I）。相反，短暂和稳定的LINC00887敲减产生了相反的效果（图2J, K）。这些发现为LINC00887促进H3K27cr水平提供了证据。

3）LINC00887通过诱导GCN5表达提高H3K27cr水平

接下来，我们研究了LINC00887增加H3K27cr的机制。GCN5在结直肠癌组织中显著升高。研究发现，稳定和短暂的敲低LINC00887会降低GCN5的表达，而过表达LINC00887会提高GCN5的表达水平（图3A-C）。此外，一项涉及LINC00887质粒和siGCN5共转染的拯救实验恢复了H3K27cr水平（图3D）。随后，我们研究了GCN5启动子组蛋白H3K27修饰的改变。结果显示，LINC00887过表达上调了该区域的H3K27ac水平，但没有上调H3K27cr水平（图3E）。为了研究LINC00887影响GCN5启动子上H3K27ac富集的分子机制，我们初步检测了LINC00887在CRC细胞中的定位，揭示了主要的核定位。因此，我们假设LINC00887是否通过与乙酰化相关酶的相互作用调控GCN5启动子上H3K27ac的富集。随后，进行RIP实验以鉴定与LINC00887相互作用的蛋白。结果显示SIRT3和LINC00887之间存在显著的相互作用（图3F）。这种相互作用通过RNA-FISH实验进一步证实，显示它们在细胞核中共定位（图3G）。我们还观察到，LINC00887过表达降低了GCN5启动子中SIRT3的富集，而LINC00887敲低则增加（图3H）。这些发现表明LINC00887与SIRT3相互作用。它的过表达阻碍了SIRT3与GCN5启动子的结合，使该区域的H3K27ac水平升高，激活GCN5转录，最终使H3K27cr水平升高。

4）H3K27cr调节CRC组织上皮细胞的细胞粘附

我们研究了H3K27cr在调节侵袭中的作用机制。我们用NaCr处理结直肠癌细胞，并观察到侵袭和迁移能力的增强（图4A, B）。随后，我们分析了Liao等人报道的具有被H3K27cr占据的启动子的基因的功能通路。共富集了20个通路，包括细胞间粘附通路。接着，进行了单细胞RNA测序（scRNA-seq）分析，以评估这些20个通路在特定细胞类型中的存在情况。在GSE163974数据集中分析了总共1,688个细胞，识别出八个不同的细胞亚型（图4C）。通过比较不同细胞亚型中的20个通路，观察到细胞间粘附通路在来自结直肠癌组织的上皮细胞中特异性富集（图4D）。这一结果在之前分析过的GSE221575数据集中得到了进一步证实（图4E）。用NaCr处理的结直肠癌细胞减少了E-钙粘蛋白，同时诱导了N-钙粘蛋白的表达（图4F, G）。这一发现暗示H3K27cr可能通过其对细胞粘附的影响，在结直肠癌转移中发挥调节作用。

5）LINC00887促进结直肠癌细胞的侵袭和迁移

考虑到LINC00887对H3K27cr水平的促进作用，我们研究了LINC00887对加速侵袭和迁移的影响。研究结果显示，LINC00887过表达增加了CRC细胞的侵袭和迁移水平，而立即和持续敲低LINC00887可降低这些水平（图5A-C）。此外，立即和持续敲低LINC00887可上调E-cadherin的表达，下调N-cadherin和vimentin的表达，而过表达LINC00887则对这些标记物具有相反的作用（图5D-F）。这些结果表明，LINC00887促进了CRC细胞的侵袭和迁移。

6）LINC00887通过H3K27cr介导的细胞粘附分子促进侵袭和迁移

我们研究了LINC00887是否通过H3K27cr调节侵袭和迁移。我们在HCT116细胞中进行了拯救实验，实验中转染了siLINC00887并使用了10mM NaCr处理。结果显示，NaCr处理恢复H3K27cr水平后，侵袭和迁移水平以及E-钙粘蛋白、N-钙粘蛋白和波形蛋白的水平也得到了恢复（图6A, B）。此外，拯救实验表明，GCN5敲减恢复了LINC00887调节的E-钙粘蛋白和波形蛋白水平（图6C），这表明LINC00887通过GCN5/H3K27cr途径调节结直肠细胞的侵袭和迁移。接下来，使用WGCNA在来自正常和结直肠癌组织的上皮细胞中识别了91个共表达模块（图6D）。在这些模块中，有8个模块在结直肠癌来源的上皮细胞中表达降低，而16个模块表达增加（图6E）。有10个模块中的基因与EMT通路基因显著相关。其中两个模块与602个基因表现出强烈的关联（图6F）。我们对GSE110009数据库中602个以上的单细胞基因进行了mapping分析。分析显示，它们在正常、结直肠癌和转移组织的B细胞和上皮细胞中显著富集（图6G， H）。随后，对这602个基因的生物学途径进行了注释。结果表明，83条通路至少包含5个基因。在上皮细胞中比较这83种通路发现，CAMs在来自转移组织的上皮细胞中表现出特异性富集（图6I）。值得注意的是，这一结果在之前分析过的GSE225857数据集中得到了证实（图6J）。这些发现表明，LINC00887通过H3K27cr调节转移组织上皮细胞的CAMs通路。

7）LINC00887通过提高YEATS2的募集来促进ETS1的表达

ETS1调节CAMs基因的表达。我们接下来研究了LINC00887是否影响ETS1的表达。我们的观察发现，LINC00887过表达增加了ETS1的水平，而LINC00887敲减则表现出相反的效果（图7A–D）。此外，通过共转染HCT116细胞LINC00887质粒和siETS1进行了拯救实验，发现ETS1敲减恢复了侵袭和迁移的水平，以及E-钙粘蛋白、N-钙粘蛋白和波形蛋白的表达（图7E, F），这表明LINC00887通过ETS1调节转移。接下来，我们研究了LINC00887对ETS1的调控机制。我们发现ETS1表达依赖于NaCr浓度，随着NaCr浓度的增加，ETS1表达也增加（图7G）。因此，对ETS1启动子的分析显示，LINC00887过表达增加了GCN5、YEATS2和H3K27cr在这一区域的富集。相反，LINC00887敲减产生了相反的效果（图7H–J）。拯救实验显示，GCN5或YEATS2敲减恢复了LINC00887调节的ETS1表达（图7K）。总的来说，结果表明LINC00887增强了ETS1启动子中GCN5、H3K27cr和YEATS2的富集，激活了ETS1表达。

8）体内抑制LINC00887可抑制结直肠癌转移

最后，我们在体内研究了LINC00887在调节CRC转移中的作用（图8A）。结果发现，抑制LINC00887能有效抑制HCT116细胞的转移。然而，当用NaCr处理小鼠时，这种抑制作用被消除（图8B， C）。此外，观察到抑制LINC00887降低了GCN5， H3K27cr和vimentin水平。用NaCr处理后，这些减少被逆转（图8D， E）。总之，我们的研究结果表明，LINC00887和SIRT3之间的相互作用使SIRT3从GCN5启动子中移位。这种位移增加了GCN5启动子处的H3K27ac水平，激活了GCN5的表达，提高了H3K27cr的总体水平。因此，GCN5向ETS1启动子的募集增强，提高了该区域的H3K27cr水平。这种增强的富集进一步促进了YEATS2的募集，增加了ETS1的表达和CRC转移（图8F）。

结论：

LINC00887过表达促进GCN5募集到ETS1启动子，导致H3K27cr富集并被YEATS2识别。最终，这一事件级联导致ETS1转录增强和CRC转移。这些发现支持了LINC00887和H3K27cr在促进结直肠癌转移中的作用。

实验方法：

单细胞测序，Western blotting，qRT-PCR，Transwell，ChIP-seq，ChIP-qPCR，RIP，FISH，IHC。

参考文献：

Liao M, Zheng W, Wang Y, Li M, Sun X, Liu N, Yao J, Dong F, Wang Q, Ma Y, Mou J. LINC00887 promotes GCN5-dependent H3K27cr level and CRC metastasis via recruitment of YEATS2 and enhancing ETS1 expression. Cell Death Dis. 2024 Sep 30;15(9):711. doi: 10.1038/s41419-024-07091-w.