高级别浆液性卵巢癌 PTEN 丢失与巨噬细胞动力学的关系

高级别浆液性卵巢癌(HGSC)仍然是一种预后不良的疾病，对目前的免疫检查点抑制剂无反应。虽然 PI3K 途径的改变，如 PTEN 缺失，在 HGSC 很常见，但是针对这一途径的尝试并不成功。我们假设异常的 PI3K 途径激活可能改变 HGSC 免疫微环境并提供靶向机会。单细胞 RNA 测序鉴定了小鼠模型中特异于 Pten 无效网膜肿瘤的驻留巨噬细胞群体，流式细胞术证实了这一点。这些巨噬细胞来源于腹腔液巨噬细胞，表现出独特的基因表达程序，以血红素加氧酶 -1(HMOX1)的高表达为标志。靶向腹腔巨噬细胞阻止了 HMOX1^hi 巨噬细胞的出现，减少了肿瘤的生长。此外，直接抑制 HMOX1延长体内存活。RNA 测序鉴定了 Pten 缺失肿瘤细胞中的 IL33作为可能的候选驱动因子，导致了 HMOX1hi 巨噬细胞的出现。人类 HGSC 肿瘤中也含有 HMOX1^hi 巨噬细胞及其相应的基因表达程序。此外，这些巨噬细胞的存在与激活的肿瘤 PI3K/mTOR 信号传导和 HGSC 患者的总生存率差有关。相比之下，HMOX1^hi 巨噬细胞数量少的肿瘤表现为适应性免疫应答基因表达增加。这些数据表明靶向 HMOX1^hi 巨噬细胞是治疗不良预后 HGSC 的一种潜在的治疗策略。本文于2024年11月发表于《Cancer Immunology》，IF：12.5

研究技术路线：

研究结果：

1. Pten-null细胞依赖于肿瘤微环境加速肿瘤生长

为了解决 PTEN 缺失如何影响 HGSC 生长，我们利用匹配的 ID8细胞，单独使用 Trp53或我们以前产生的 Trp53和 PTEN 中的失活突变。使用多个单独的克隆，我们证实在腹膜内注射后，与 Trp53^-/-相比，Trp53^-/-; Pten^-/-ID8细胞导致显着缩短的存活(图1A)。如前所述，Pten 缺失在2D 高附着条件下(图1B 和 C) ，包括具有额外的 Brca2突变(图1D)以及在低血清和血清饥饿条件下(图1E) ，提示增强的腹膜内生长不是肿瘤细胞固有的。

肿瘤细胞必须抵抗失巢凋亡，然后在低附着条件下生长，以促进 HGSC 的腹膜播散。Trp53^-/-和 Trp53^-/-; Pten^-/-ID8克隆在体外低附着条件下形成球状簇，但随着时间的推移，两种基因型的收缩率是相等的(图1F)。在体内，Pten 丢失在腹腔注射后没有立即的生存优势(图1G)。S1C)。然而，注射后14天，腹腔液中 Pten 无效细胞显著扩增(图1G)。此外，在注射 Trp53^-/-； Pten^-/-细胞的小鼠中，HGSC 转移的主要部位网膜中的肿瘤负荷在第14天更大，在第25至28天显着更大(图1H)。

为了确保我们的发现不是 ID8特异性的，我们使用了 HGS2，一种由 Trp53^fl/fl，Brca2^fl/fl，Pten^fl/fl，Pax8^Cre 转基因小鼠中产生的肿瘤产生的细胞系。我们使用慢病毒在 HGS2中重新表达 Pten，这并不影响倍增时间在二维高附着(图1I)或形成球体的能力在低附着(图1J)。但与对照病毒感染的细胞相比，在体内产生较小的网膜肿瘤(图1K)。总之，这些数据强烈表明腹膜微环境支持 Pten 无效肿瘤的加速生长。

Figure 1 Pten-null细胞依赖于肿瘤微环境加速肿瘤生长

2. Pten-null肿瘤细胞增强了网膜内驻留样巨噬细胞的积累

我们假设巨噬细胞支持 Pten-null肿瘤的播种和生长。在小鼠的腹膜腔和网膜中存在两个主要的巨噬细胞群体: 不断由血液 Ly6C^hi 单核细胞补充的 F4/80^loMHCII^hi 单核细胞来源的巨噬细胞和胚胎来源的 F4/80^hiMHCIIl^o 驻留巨噬细胞，它们都是自我维持和从当地的 F4/80^loMHCII^hi 库中补充的。在确认了我们的门控策略的特殊性之后，我们首先评估了巨噬细胞/单核细胞群在肿瘤生长过程中的变化。ID8细胞注射1天内引起 Ly6C^hi 单核细胞流入腹腔液。在 Trp53^-/-; Pten^-/-注射的小鼠中，这种浸润在第14天显著增加(图2A)。可能来源于该单核细胞库的 F4/80^loMHCII^hi 巨噬细胞的增加(图2B)在 Trp53^-/-; Pten^-/-注射后14天也是明显的。在 Trp53^-/-; Pten^-/-注射的小鼠中，网膜驻留的 F4/80^hiMHCII^lo 群体在第14天增加(图2C)。有趣的是，在第28天，当两种基因型都有相当大的肿瘤负荷时，Trp53^-/-; Pten^-/-网膜肿瘤在多个亚克隆中含有显着更多的驻留样巨噬细胞(图2D)。此外，大约40% 的驻留样巨噬细胞表达长期驻留标记 TIM4 ⁺ ，表明它们不是新招募的(图2E 和 F)。

我们还使用了具有或不具有 Pten-null的 Trp53^-/-; Brca2^-/-ID8细胞。单独的 Brca2缺失并不影响驻留巨噬细胞的扩张(图2G)。然而，Pten 的额外缺失再次显着增加了驻留巨噬细胞的密度(图2G) ，这与单核细胞来源的巨噬细胞和 T 细胞的相对缺乏相结合(图2H 和 I)。这与体内侵略性的增加有关。除了 Pten 之外，Brca2的缺失拯救了单独使用 Pten 损失观察到的单核细胞衍生的巨噬细胞和 T 细胞的募集(图2J 和 K) ，表明 Pten 缺失特异性地改变驻留巨噬细胞而不是诱导免疫微环境中的全局变化。

为了确定驻留巨噬细胞是否是Pten-null网膜肿瘤生长的驱动因素，我们首先在肿瘤接种之前使用腹膜内氯膦酸盐包封的脂质体(CEL)耗尽所有巨噬细胞。这种泛巨噬细胞的消耗完全阻止了 Trp53^-/-; Pten^-/-网膜肿瘤的形成和腹水的产生(图2L)。不幸的是，如先前报道的，CEL 注射后观察到的高死亡率阻碍了我们机构使用 CEL 的进一步研究。为了进一步解剖巨噬细胞对 Pten-null肿瘤生长的贡献，我们利用缺乏 Ccr2的一个(Ccr2^RFP/+)或两个拷贝(Ccr2^RFP/RFP)的小鼠，因此显着减少了骨髓单核细胞的出口。正如预期的那样，Ccr2^RFP/+ 和 Ccr2^RFP/RFP 小鼠的腹膜液和网膜中的单核细胞和单核细胞来源的巨噬细胞显着减少，驻留巨噬细胞库没有改变。引人注目的是，Ccr2的缺失显着增加了 Trp53^-/-; Pten^-/-注射的小鼠中的肿瘤负荷和腹水体积(图2M) ，表明单核细胞衍生的巨噬细胞在 Pten-null肿瘤接种和生长期间具有保护性抗肿瘤作用。

Figure 2 Pten-null的肿瘤细胞增强了网膜内驻留样巨噬细胞的积累

3. Pten-null肿瘤驱动一个独特的 HMOX1^hi 巨噬细胞亚群的出现

巨噬细胞表型不能简化为二元 M1/M2标记物表达，网膜肿瘤中存在多种不同的亚型。因此，我们使用 SMART-Seq2方案对来自网膜肿瘤的流式分选巨噬细胞进行 scRNA-seq。统一流形近似和投影聚类显示了五个不同的聚类(图3A 和 B)。簇0表达在单核细胞衍生的巨噬细胞中经典发现的基因，包括 MHCII 相关分子(H2-Eb1，H2-DMb2，H2-DMb1，H2-Ab1，Cd74，H2-Oa 和 H2-Aa) ，趋化因子受体 Ccr2，Cx3cr1和共刺激分子 Cd86。通过流式细胞术，簇0也定位于 F4/80^loMHCII^hi 区(图3C)。簇1和簇3均表达腹膜巨噬细胞定义的基因。簇1表达 Fcna (ficolin 1) ，Fn1(纤连蛋白1)和类视黄醇 X 受体 Rxra，并且通过流式细胞术主要位于 F4/80^loMHCII^hi 区域(图3C)。簇3表达更多的经典腹膜驻留基因，包括 Ltbp1，Garnl3，Serpinb2，Alox15，Selp，F5，Timd4，Icam2(CD102)和 Gata6。通过流式细胞术定位于 F4/80^hiMHCII^lo 区域的簇3(图3C) ，其与 TIM4(Timd4)的表达一起表明簇1是转变成簇3的单核细胞衍生的前体。簇4表达的基因通常在上皮细胞或间皮细胞(Krt18，Krt19，Msln，Wt1)中发现，这表明它们可能是吞噬巨噬细胞。

最有趣的簇是簇2，它几乎完全在 Trp53^-/-，Pten^-/-肿瘤中发现(图3A 和 B) ，并且具有高表达的 HMOX1(Hmox1) ，这是一种酶，催化血红素分解成一氧化碳，铁(Fe^{2 +})和胆绿素。簇2还表达参与脂质积累的基因，如 Trib3(Tribbles 假激酶 -3)和 Lgals3(半乳糖凝集素3) ，以及防止重金属毒性的基因，如金属硫蛋白 Mt1和 Mt2。簇2还表达了与免疫抑制相关的基因，包括 Cd274(PD-L1) ，Arg1(精氨酸酶1)和 Vegfa。通过流式细胞术，簇2主要定位于 F4/80^hiMHCII^lo 区域，表明它可能来源于腹膜巨噬细胞(图3C)。我们使用 Monocle3进行假时间分析来估计假定的分化方向。当重新聚集时，选择第0组作为起始节点，假时间预测第2组来源于第1组和第3组(图3D) ，表明它代表腹膜驻留巨噬细胞的一个亚型。

我们通过流式细胞术在早期(进行腹水形成)和晚期(存在腹水)时间点证实了这些巨噬细胞亚群的存在(图3E 和 F)。这证实了在 Trp53^-/-; Pten^-/-肿瘤中早期存在簇2巨噬细胞(定义为 Arginase1⁺ PD-L1⁺ 或 HMOX1^hi) ，并且在晚期肿瘤中显着增加(图3G 和 H)。我们还使用 IHC 验证了 ID8网膜肿瘤切片中 HMOX1⁺ 细胞的存在(图3I) ，其中它们在脂肪细胞周围和肿瘤边界中被观察到(图3J)。

我们接下来评估了 HMOX1在簇2中表达的选择性。使用 Hmox1^GFP 转基因小鼠，我们证实只有单核细胞和巨噬细胞表达 HMOX1(图3K)。尽管 LYVE1 ⁺ 间皮细胞衬里群体(占总巨噬细胞的一小部分)具有最高的表达，但是簇2(精氨酸酶1 ⁺ PD-L1 ⁺)高度表达 HMOX1，其次是 CD102 ⁺ 腹膜巨噬细胞。CD11c ⁺ MHCIIhi 单核细胞来源的巨噬细胞和单核细胞表达较弱，其他群体表达较弱或不表达。当组合时，我们的数据显示精氨酸酶1 ⁺ PD-L1 ⁺ HMOX1^hi 巨噬细胞在 Trp53^-/-; Pten^-/-肿瘤中显着富集(图3L)。

Figure 3 Pten-null的肿瘤细胞增强了网膜内驻留样巨噬细胞的积累

4. HMOX1^hi 巨噬细胞来源于腹腔液巨噬细胞

为了检验腹腔液驻留巨噬细胞是 HMOX1^hi 巨噬细胞的主要来源的假设，我们首先在 ID8细胞注射后24小时或13天将 AT CD45.1⁺ 腹腔液细胞(包括单核细胞，单核细胞来源的和驻留巨噬细胞)转化为 CD45.2⁺ 小鼠。在网膜肿瘤中检测到 CD45.1⁺ 细胞，证明腹腔液和肿瘤之间可以发生运输(图4A)。有趣的是，驻留的 CD45.1⁺ F4/80^hiMHCII^lo 细胞富含 Trp53^-/-; Pten^-/-肿瘤(图4B 和 C，左) ，并相应地在腹水中耗尽(图4B 和 C，中)。大多数 CD45.1⁺ 巨噬细胞是 TIM4⁺ ，表明长期居住(图4B 和 C，右)。为了进一步确定 HMOX1^hi 巨噬细胞是否可以来源于腹腔液，我们将来自健康 HMOX1^GFP 小鼠的腹腔液 F4/80^hiCD102⁺ 细胞分选并将其 AT 到携带 Trp53^-/-; Pten^-/-肿瘤的 HMOX1^wt 同窝仔鼠中(图4D)。我们在 Trp53^-/-; Pten^-/-网膜肿瘤(图4E)中检测到 HMOX1^GFP 细胞，其表型复制宿主自身的群体(CD11^c-MHCII^lo，CD102⁺ 精氨酸酶1+)并且几乎完全来自长期驻留的 CD102⁺ TIM4⁺ 细胞(图4F)。然而，宿主巨噬细胞库中的一部分 CD102^-细胞具有高精氨酸酶1和 PD-L1表达(图4G 和 H) ，表明一些簇2巨噬细胞也可能来源于非 CD102⁺ 腹膜液细胞。

Figure 4 HMOX1hi 巨噬细胞部分来源于腹腔液巨噬细胞

5. HMOX1抑制延长生存期

为了了解 HMOX1是否是 HGSC 潜在的治疗靶点，我们使用了 HMOX1抑制剂中卟啉锡(SnMP; ref)。SnMP 处理不影响 MHCIIhiCD11c⁺ 单核细胞衍生的或 CD102⁺ F4/80^hi 巨噬细胞的网膜密度(图5A 和 B) ，但确实增加了精氨酸酶1⁺ PD-L1⁺ HMOX1⁺ 巨噬细胞的密度(图5C)。这可能是对 HMOX1抑制反应的补偿机制，因为已知 SnMP 刺激 HMOX1上调，同时仍然阻断酶活性。有趣的是，HMOX1抑制消耗了 LYVE1⁺ 巨噬细胞(图5D) ，这表明它们对血红素诱导的毒性敏感，与它们接近肿瘤脉管系统一致。SnMP 治疗14天可减少腹水形成，但无显著性差异(P = 0.078; 图5E)。然而，延长的 SnMP 作为5天/2天休息制度给予，显着增加了 Trp53^-/-; Pten^-/-荷瘤小鼠的存活(危险比0.32,95% CI，0.11-0.94，P = 0.002; 图5F)。

Figure 5 HMOX1抑制延长携带 Pten-null ID8肿瘤的小鼠的存活

6. IL33作为簇2巨噬细胞的潜在驱动因素

为了确定 Pten-null肿瘤细胞如何驱动巨噬细胞扩增，我们最初筛选了趋化因子和细胞因子的表达。这表明在一些 Pten-null细胞中 Ccl2和 Ccl7的表达显著增加，但不在另外缺乏 Brca2的细胞中。我们还分析了视黄酸产生酶 Raldh1,2和3的表达，因为腹膜和网膜驻留巨噬细胞由视黄酸支持，其驱动其驻留基因表达程序，包括 Gata6。然而，通过 Pten 缺失，Raldh1的表达并没有持续改变。而 Raldh2和3在所有细胞中的表达可以忽略不计。此外，Trp53^-/-; Pten^-/-细胞没有表现出增强的募集骨髓来源的巨噬细胞的能力，而 Ccr2的缺失导致骨髓来源的巨噬细胞向两种基因型的募集减少。PTEN 缺失可以驱动前列腺癌中 IL6的产生。然而，在 Trp53^-/-; Pten^-/-ID8细胞(CT 值)中 Il6表达较弱，克隆之间没有统计学差异，尽管 IL6蛋白不能被 ELISA 检测到。编码血管内皮生长因子的 Vegfa 也没有受到 Pten 丢失的影响。综上所述，这些数据表明，一个或多个超越 Ccl2和 Ccl7的因子在体内产生，支持驻地巨噬细胞的募集和扩张。簇2的基因特征使我们能够进一步剖析 HMOX1^hi 巨噬细胞的潜在驱动因素。我们首先分析了 Trp53^-/-; Pten^-/-ID8细胞的大量 RNA-seq 分析。使用这种方法，我们发现与 Trp53^-/-ID8细胞相比，Trp53^-/-; Pten^-/-中有4,505个基因显着上调(图5G)。使用 IPA (图5H) ，我们鉴定了簇2的25个潜在的上游调节因子，其中16个与 Pten 无效细胞中也上调的基因重叠(图5I)。在这些基因中，我们将 Il33鉴定为刺激簇2基因表达的可能候选基因，因为它既是分泌因子，又预测激活簇2中最大的基因组之一(图5J)。我们证实在 Pten 缺失的 ID8系中 Il33基因和 IL33蛋白表达增加(图5K)。然后我们在 IL33存在下培养腹腔液驻留巨噬细胞，观察到 Hmox1基因表达显著增加(图5L)。

7. 小鼠和人类 HMOX1hi 巨噬细胞具有共同的特征

为了确保我们的小鼠数据与 HGSC 患者相关，我们分析了一个大型 scRNA-seq 数据集，其中包含来自42名新诊断的初治 HGSC 患者的160个活组织检查的数据。肿瘤相关巨噬细胞(n = 166,895)基于已知的标记基因(包括 PTPRC，CD14，FCER1G 和 CD68)进行注释。我们首先根据 HMOX1表达对人巨噬细胞进行分类，将 HMOX1表达大于平均值1SD 的巨噬细胞定义为 HMOX1^hi (图6A)。然后我们比较了 HMOX1hi 巨噬细胞和每个小鼠群的 DEG。簇2显示 HMOX1^hi 细胞中重叠基因(n = 39)最多(图6B)。同样，在 HMOX1^hi 巨噬细胞的87 DEG 中，最高比例(44.8% ，n = 39/87) 与簇2共享。HMOX1^hi 巨噬细胞富含驻留巨噬细胞(LYVE1) ，血红素代谢(BLVRB) ，细胞对缺氧(HILPDA) ，金属硫蛋白(MT1E，MT1F，MT1G，MT1H 和 MT1M) ，铁转运蛋白，储存和体内平衡(SLC40A1，HAMP，FTH1和 FTL)和脂质代谢和储存(APOC1，PLIN2和 LIPA; 图6C)。相反，HMOX1lo 巨噬细胞富含干扰素 γ 应答基因(CXCL9和 CXCL10) ，免疫细胞和 T 细胞募集基因(CCL5，CXCL9，CXCL10，CXCL11和 IL1B)和 MHCII 基因(HLA-DQA1; 图6C)。对 HMOX1hi 巨噬细胞转录组的 MSigDB富集分析揭示了在小鼠簇2中也发现的缺氧反应，离子稳态，脂质代谢和 mTORC1信号传导途径的富集(图6D)。因此，人类 HGSC 包含一组巨噬细胞，它们与小鼠簇2具有共同的特征，并且具有高 HMOX1表达、组织驻留、拥有属性氧化应激反应和低促炎细胞因子/趋化因子表达。

Figure 6 小鼠和人 HMOX1hi 巨噬细胞在 HGSC 中具有共同的特征

8. HMOX1^hi 巨噬细胞与 HGSC 中 OS 和 PI3K 信号通路激活的关系

在小鼠中，簇2巨噬细胞几乎只在 Pten-null肿瘤中发现(图3A 和 B)。在 scRNA-seq 数据集中，来自富含 HMOX1^hi 巨噬细胞的肿瘤的癌细胞。S8A 表现出高 mTOR 信号传导和高胰岛素样生长因子信号传导(图7A) ，可激活 PI3K/AKT 信号传导。相比之下，HMOX1^hi 巨噬细胞富集的肿瘤中免疫相关通路下调(图7A)。

在 BriTROC-1研究中，来自172名患者的诊断性 HGSC 样品上的 IHC 表现出 HMOX1和 CD68之间的强相关性(图7B 和 C) ，使我们能够使用高 HMOX1表达作为 HMOX1^hi 巨噬细胞的替代物。HMOX1^hi 巨噬细胞的存在与肿瘤细胞中阳性 pAKT (S473)染色呈正相关，尽管很弱(图7D 和 E)。S8B) ，并且在调整年龄和分期后也与 BriTROC-1患者的生存率降低独立相关[ HR = 1.80(1.07-3.0) ; 图7F 和 G ]。高 HMOX1表达对预后的影响在 mRNA 水平的单独验证队列中得到证实。

Figure 7 高比例的 HMOX1^hi 巨噬细胞与较差的 OS 和 PI3K 信号通路激活有关

研究结论

总之，我们已经表明 HMOX1^hi 巨噬细胞具有常见的基因表达程序，包括免疫抑制，缺氧，胆固醇流出和脂质转运，可以在小鼠和人类 HGSC 中鉴定。HMOX1^hi 巨噬细胞在 HGSC 中的功能仍有待充分了解，基因表达途径可能反映了诱导 HMOX1^hi 细胞的 PI3K 驱动的微环境和整体巨噬细胞功能。尽管如此，我们的研究强调 HMOX1抑制可能为 HGSC 提供相关的治疗策略。

研究方法：

细胞培养，RNA 提取和 cDNA 合成，SMART-Seq2 单细胞 RNA 测序，CD45.1 采血转移，HMOX1^GFP 巨噬细胞采血转移，腹腔常驻巨噬细胞体外刺激，单细胞 RNA 测序数据分析，ID8 批量 RNA 测序数据分析，HMOX1 在独立验证队列中的诊断价值，统计分析。

参考文献：

Spear S, Le Saux O, Mirza HB, Iyer N, Tyson K, Grundland Freile F, Walton JB, Woodman C, Jarvis S, Ennis DP, Aguirre Hernandez C, Xu Y, Spiliopoulou P, Brenton JD, Costa-Pereira AP, Cook DP, Vanderhyden BC, Keun HC, Triantafyllou E, Arnold JN, McNeish IA. PTEN Loss Shapes Macrophage Dynamics in High-Grade Serous Ovarian Carcinoma. Cancer Res. 2024 Nov 15;84(22):3772-3787. doi: 10.1158/0008-5472.CAN-23-3890IF: 12.5 Q1 . PMID: 39186679IF: 12.5 Q1 ; PMCID: PMC7616669IF: 12.5 Q1 .