半凝集素-9在缺氧脑肿瘤微环境中介导小胶质细胞的功能

半乳糖凝集素-9是多种病理生理过程的多方面调节因子，以上下文依赖的方式发挥积极或消极的作用。在这里，作者阐明了半乳糖凝集素-9在脑肿瘤微环境中对髓系细胞的独特功能特性。半凝集素-9在肿瘤浸润细胞的小胶质细胞和巨噬细胞中高表达。在原代胶质细胞中，半乳糖凝集素-9的表达和分泌均受肿瘤的影响。对人类胶质母细胞瘤大量RNA测序数据集和来自小鼠胶质瘤模型的单细胞RNA测序数据集的分析揭示了半乳糖凝集素-9表达与胶质细胞活化之间的相关性。在脑肿瘤微环境中，半凝集素-9高的小胶质细胞亚群在功能上不同于半凝集素-9阴性/低的小胶质细胞亚群。高半乳糖凝集素-9的小胶质细胞表现出炎症激活和更高的细胞死亡率，而低半乳糖凝集素-9的小胶质细胞对脑肿瘤细胞表现出优越的吞噬能力。在小鼠胶质瘤模型中，阻断半乳糖凝集素-9抑制肿瘤生长并改变胶质细胞和T细胞的活性。这些发现表明骨髓细胞上的半乳糖凝集素-9是一种免疫调节剂，也是脑肿瘤的推定治疗靶点。该文章于2024年11月发表在《cancer research》，IF：14.2。

摘要图：

主要研究结果：

1. 半乳糖凝集素-9在颅内小鼠肿瘤模型的荷瘤同侧半球高表达

半乳糖凝集素-9似乎作为病理生理过程的多方面调节因子，以上下文依赖的方式发挥积极或消极的作用。为了更好地了解脑TME的免疫景观，作者使用颅内GL26小鼠胶质瘤模型研究了半乳糖凝集素-9的表达特征。WB显示，与对侧半球相比，雌性和雄性小鼠的同侧半球中半乳糖凝集素-9的表达明显更高（图1A）。在使用B35细胞的大鼠模型中观察到类似的结果（图1B和C）。免疫组织化学显示，半乳糖凝集素-9在同侧区域的表达明显高于对侧区域（图1D）。

接下来，作者使用表达EGFP的GL26小鼠研究了哪些细胞类型表达半乳糖凝集素-9。免疫组化显示，半乳糖凝集素-9在EGFP阳性的肿瘤细胞和肿瘤周围细胞上均有表达（图1E）。如图1F和G所示，半乳糖凝集素-9与CD3+ T细胞、IBA-1 +小胶质细胞和GFAP+星形胶质细胞共定位，在肿瘤边缘（即肿瘤病变与正常组织之间的界面）比肿瘤核心更明显。然而，作者没有在new +神经元中检测到半乳糖凝集素-9。为了验证这些发现，作者检测了GL26小鼠肿瘤浸润免疫细胞中半乳糖凝集素-9的水平。流式细胞术显示，与对侧肿瘤区域相比，同侧肿瘤区域的小胶质细胞（CD45midCD11b+）、巨噬细胞（CD45highCD11b+）和淋巴细胞（CD45highCD11b -）中的半凝集素-9水平显著增强（图1H）。这些结果表明半乳糖凝集素-9可能在脑TME内肿瘤周围免疫细胞中发挥特定作用。

2. 小胶质细胞半凝集素-9的表达在脑肿瘤中发生改变，并与炎症事件有关

小胶质细胞是至关重要的脑驻留前哨细胞，在第一道防线中起着至关重要的作用，脑肿瘤肿块通常由高达40%的髓系细胞组成，包括小胶质细胞。因此，作者主要关注小胶质细胞中的半凝集素-9，研究了小胶质细胞半凝集素-9的表达是否可以被脑肿瘤调节。半乳糖凝集素-9的转录物和蛋白水平在暴露于脑肿瘤CMs的原代胶质细胞中明显升高。随着时间的推移，在初级小胶质细胞中观察到这种增加（图2A）。FACS和免疫细胞化学分析进一步显示，与PACM相比，gl26cm处理的小胶质细胞细胞质和细胞表面半乳糖凝集素-9水平显著升高（图2B）。原代小胶质细胞与GL26-EGFP细胞共培养也导致小胶质细胞半乳糖凝集素-9的升高（图2C）。此外，间接共培养增强了半乳糖凝集素-9的表达和Ki-67+增殖小胶质细胞的比例。然后，作者监测原代胶质细胞分泌半乳糖凝集素-9，发现gl26cm处理的胶质细胞比PACM处理的胶质细胞分泌更多（图2D），表明肿瘤源性因子以旁分泌模式影响胶质半凝集素-9。

图1 半凝集素-9在颅内肿瘤模型的同侧半球表达升高

据报道，分泌的半乳糖凝集素-9在某些病理条件下作为一种损伤相关分子模式（DAMP）。为了评估半乳糖凝集素-9在脑TME中的功能特性，作者使用重组半乳糖凝集素-9（rmGal-9）检测了外源性半乳糖凝集素-9在免疫和炎症反应中的作用。用rmGal-9治疗小胶质细胞显著增加了半乳糖凝集素-9的转录物和蛋白水平，以及白细胞介素（IL）-1和IL-6等炎症细胞因子（图2E-G）。FACS分析显示rmGal-9升高炎症相关分子的水平，包括toll样受体（TLR）-2和程序性死亡配体1 （PD-L1，图2H）。

图2 小胶质细胞半凝集素-9在脑肿瘤中表达上调

这些发现促使作者研究脑TME中半乳糖凝集素-9表达与神经胶质活化之间的关系。作者分析了最初由Ochocka等人获得的小鼠GL261胶质瘤CD11b+细胞的scRNA-seq数据。与对照组相比，肿瘤组织中的小胶质细胞和胶质瘤相关巨噬细胞的Lgals9表达更高。使用MG评分，定义为小胶质细胞激活特征基因- TMEM119， P2ry12， Cx3cr1， Olfml3， Sparc和Gpr34，作者发现Lgals9水平与小胶质细胞簇中的小胶质细胞激活之间存在显著相关性。同样，TCGA-GBM分析显示Lgals9表达与TMEM119之间存在强正相关（图2I）。综上所述，这些结果表明神经胶质半乳糖凝集素-9的表达和分泌受到脑肿瘤的影响，半乳糖凝集素-9在脑TME内肿瘤暴露的神经胶质中诱导炎症反应。

3. 半凝集素-9高的小胶质细胞比半凝集素-9阴性/低亚群表达更高水平的炎症介质

鉴于上述发现，作者试图探索脑TME中半乳糖凝集素-9高表达和负/低表达的胶质细胞的功能特征。作者首先检查了半乳糖凝集素-9高和半乳糖凝集素-9阴性/低的小胶质细胞中代表性炎症相关分子的水平。与上述结果一致，在CD11b+半凝集素-9高的小胶质细胞中，TLR-2、TLR-4和PD-L1的水平明显高于CD11b+半凝集素-9阴性/低的小胶质细胞（图3A）。相反，半乳糖凝集素-9高和半乳糖凝集素-9阴性/低小胶质细胞亚群的TIM-3水平无显著差异。接下来，作者分析了gl26cm处理的TLR-2高表达小胶质细胞和PD-L1高表达小胶质细胞中半乳糖凝集素-9的水平。如图3B和C所示，与模拟处理的对照组相比，GL26CM显著增加了TLR-2高水平的小胶质细胞的比例，并且这些TLR-2高水平的细胞比TLR-2阴性/低水平的小胶质细胞表现出更高的半凝集素-9水平。同样，gl26cm诱导的高PD-L1小胶质细胞比暴露于GL26CM的低PD-L1亚群显示出更高的半乳糖凝集素-9水平（图3D和E）。这些发现进一步支持了半乳糖凝集素-9的表达与脑TME中小胶质细胞的炎症特性密切相关。

4. 半凝集素-9高的小胶质细胞比半凝集素-9阴性/低的小胶质细胞有更高的细胞死亡率

据报道，半乳糖凝集素-9可触发T细胞凋亡，而半乳糖凝集素-9相关的细胞凋亡与几种自身免疫性疾病有关。因此，作者询问半乳糖凝集素-9是否有助于脑TME中的小胶质细胞死亡。作者首先研究了分泌的半凝集素-9是否会影响神经胶质细胞的死亡。rmGal-9处理导致小胶质细胞增殖明显减少，Annexin-V + PI+凋亡细胞显著增加（图4A）。然后，作者探讨了rmGal-9是否与caspase-1激活介导的炎症相关细胞死亡有关。FAM-FLICA和FVS-780染色显示，rmGal-9显著升高活细胞中FLICA+活性caspase-1，显著增加小胶质细胞中FLICA+ FVS-780+炎性细胞死亡（图4B）。WB和免疫细胞化学染色进一步表明，与模拟处理的对照组相比，rmgal -9处理的胶质细胞表现出气皮素-d（GSDMD）的大幅上调，GSDMD是炎症性半胱天蛋白酶的生理底物和热相关调节因子，其活性裂解形式（图4C）。这些结果表明，细胞外半乳糖凝集素-9可能引发细胞凋亡和炎症相关的胶质细胞死亡。

图3 半凝集素-9影响神经胶质细胞的炎症免疫反应

图4 小胶质半凝集素-9有助于脑TME中的细胞死亡

接下来，作者比较了半凝集素-9高和半凝集素-9阴性/低小胶质细胞亚群中凋亡细胞的程度。值得注意的是，暴露于GL26CM后，半凝集素-9高的小胶质细胞中凋亡细胞显著增加，但在半凝集素-9阴性/低的小胶质细胞中未检测到这种增加（图4D）。在与GL26-EGFP细胞共培养的原代小胶质细胞中观察到类似的结果（图4E）。为了验证这些结果，作者研究了半乳糖凝集素-9阻断是否可以减少肿瘤暴露的半乳糖凝集素-9高的小胶质细胞的细胞死亡。如图4F所示，半乳糖凝集素-9阻断显著降低了与GL26-EGFP细胞共培养的半乳糖凝集素-9高含量小胶质细胞的死亡细胞百分比，而半乳糖凝集素-9阴性/低含量小胶质细胞没有明显变化（图4F）。总的来说，这些结果表明半乳糖凝集素-9高的小胶质细胞比半乳糖凝集素-9阴性/低的小胶质细胞更容易发生细胞死亡。

5. 半凝集素-9阴性/低的小胶质细胞比半凝集素-9高的小胶质细胞表现出更强的吞噬能力

吞噬作用是中枢神经系统内小胶质细胞的基本功能。因此，作者评估了半乳糖凝集素-9高和半乳糖凝集素-9阴性/低的小胶质细胞对GL26-EGFP细胞的吞噬活性。有趣的是，半乳糖凝集素-9阴性/低的小胶质细胞比半乳糖凝集素-9高的小胶质细胞更有效地吞噬EGFP阳性的肿瘤细胞（图5A）。为了进一步评估半乳糖凝集素-9与小胶质细胞吞噬能力之间的相关性，作者检测了半乳糖凝集素-9表达与代表性抗吞噬分子如PD-1和信号调节蛋白（SIRP）-α的关系。如图5B所示，与PD-1高的小胶质细胞相比，PD-1阴性/低的小胶质细胞对肿瘤细胞的吞噬活性更高。然后作者比较了半乳糖凝集素-9高和半乳糖凝集素-9阴性/低的小胶质细胞中SIRP-α和PD-1的水平。与图5A一致，在与GL26细胞共培养的原代胶质细胞中，半乳糖凝集素-9高的小胶质细胞的SIRP-α和PD-1水平高于半乳糖凝集素-9阴性/低的小胶质细胞（图5C）。为了证实这些结果，作者研究了gl26小鼠肿瘤浸润细胞中SIRP-α和PD-1的水平。半乳糖凝集素-9高cd45midcd11b +的小胶质细胞与半乳糖凝集素-9阴性/低的小胶质细胞相比，显示出更高水平的抗吞噬分子SIRP-α和PD-1（图5D）。在CD45^highCD11b+巨噬细胞中观察到类似的结果（图5E）。

接下来，作者研究了半乳糖凝集素-9是否参与与PD-1相关的吞噬作用。为了解决这个问题，作者根据PD-1和半乳糖凝集素-9的表达将CD45midCD11b+小胶质细胞分为四个不同的亚群：PD-1 +Gal-9 -、PD-1 +Gal-9 +、PD-1 - Gal-9 +和PD-1-Gal-9-。然后作者用流式细胞术比较了小胶质细胞亚群中SIRP-α的水平。PD-1 +Gal-9 -和PD-1 +Gal-9 +小胶质细胞在同侧脑半球的比例明显高于对侧脑半球。这些亚群也表现出比其他人群更高的SIRP-α百分比（图5F）。值得注意的是，与PD-1 +Gal-9 -和PD-1 +Gal-9 +小胶质细胞相比，PD-Gal-9 -小胶质细胞中SIRP-α的百分比显著降低。同样，PD-1 +Gal-9 -和PD-1 +Gal-9+小胶质细胞的EGFP+细胞被吞噬的频率较低，而PD-1 - Gal-9 -小胶质细胞的吞噬能力比其他亚群更强（图5G）。

图5 半凝集素-9阴性/低的小胶质细胞比半凝集素-9高的小胶质细胞表现出更强的吞噬能力

然后作者探索半乳糖凝集素-9阻断是否会影响小胶质细胞的吞噬活性。与igg处理的小胶质细胞相比，抗半乳糖凝集素-9抗体处理的原代小胶质细胞显示出更高的头部摄取百分比。此外，在GL26-EGFP细胞培养的原代小胶质细胞中，半凝集素-9阻断可显著降低SIRP-α和PD-1的水平（图5H）。因此，作者研究了半乳糖凝集素-9和CD47的共同阻断是否会影响小胶质细胞肿瘤的吞噬。在原代胶质细胞和GL26-EGFP细胞共培养中，与单独使用任一抗体相比，抗半乳糖凝集素-9和抗cd47抗体共同处理显著增强了吞噬能力。同样，当原代胶质细胞在抗CD47抗体存在下与GL26-EGFP细胞共培养之前，预先暴露于具有抗半乳糖凝集素-9或同型抗体的GL26CM时，双半乳糖凝集素-9和CD47抑制比单次治疗显著增强了小胶质细胞对肿瘤细胞的吞噬作用（图5I）。总之，这些结果支持半乳糖凝集素-9可能有助于脑TME内初级胶质细胞的抗吞噬活性。

6. 阻断半乳糖凝集素-9影响肿瘤大小和脑TME中髓细胞和T细胞的活性

以上结果促使作者进一步研究抗半乳糖凝集素-9抗体对肿瘤生长的影响。GL26细胞移植7天后，腹腔注射200 μg阻断抗体或等量对照IgG；每3天重复一次，持续2周。与IgG对照组相比，半乳糖凝集素-9阻断显著降低了女性和男性肿瘤模型的肿瘤大小，延长了生存期（图6A和B；补充图S16）。肿瘤浸润细胞的FACS分析显示，半乳糖凝集素-9阻断导致CD45midCD11b+小胶质细胞和CD45highCD11b+巨噬细胞中PD-1水平降低（图6C和D）。此外，与igg处理小鼠相比，抗半乳糖凝集素-9处理小鼠的肿瘤内PD-1 +CD8+ T细胞表现出更高的TCF-1表达，TCF-1是CD8+ T细胞效应功能的关键转录因子（图6E）。

先天免疫细胞与T细胞相互作用并触发细胞毒性CD8+ T细胞的激活。因此，作者研究了半乳糖凝集素-9阻断是否会影响胶质细胞和T细胞的相互作用。将原代胶质细胞模拟处理或用GL26CM处理24小时，然后在抗半乳糖凝集素-9抗体或IgG存在下与CD8+ T细胞共培养48小时。流式细胞术显示，抗半乳糖凝集素-9抗体与GL26CM暴露的胶质细胞共培养的PD-1 +CD8+ T细胞中TCF-1水平显著升高（图6F）。ELISA进一步显示，与gl26cm处理的胶质细胞共培养时，抗半乳糖凝集素-9抗体存在时，CD8+ T细胞产生的IFN-α比对照IgG增强（图6G）。与对照IgG相比，半凝集素-9阻断也显著增加了CD107a +脱颗粒CD8+ T细胞的百分比（图6H）。然而，在单独培养的T细胞中，抗半乳糖凝集素-9抗体并不直接影响CD8+ T细胞的活性，包括增殖和细胞因子的产生。这些结果表明，在胶质细胞存在的情况下，半乳糖凝集素-9阻断会影响CD8+ T细胞的活性。

图6 半凝集素-9阻断剂在颅内肿瘤模型中显示抗肿瘤作用

基于以上结果，作者进一步研究抗半乳糖凝集素-9和抗PD -1抗体对肿瘤生长的联合作用。如图6I所示，与IgG对照相比，抗半乳糖凝集素-9或抗PD -1抗体均可显著降低肿瘤体积。值得注意的是，用这两种抗体治疗导致肿瘤大小更明显的缩小。这些结果进一步证实了半凝集素-9阻断在颅内脑肿瘤模型中的作用。

7. Hif-2α对半乳糖凝集素-9的表达和脑TME内肿瘤的生长至关重要

作者接下来的问题是半乳糖凝集素-9的表达是如何在脑TME的胶质细胞中被调节的。鉴于小鼠半乳糖凝集素-9基因的启动子区域包含2个假定的缺氧反应元件（HRE；5 ' -（A/G）CGT（G/C）（G/C）-3 '）在其启动子区域与缺氧诱导因子（Hif）（33）结合（Supplementary Fig. S20A），作者研究了半凝集素-9在脑TME中的表达是否受到Hif的调节。使用吡莫硝唑（hypoxyprobe-1），一种缺氧标志物，作者发现半乳糖凝集素-9在同侧半球肿瘤边缘的吡莫硝唑染色区域表达更为普遍（图7A），与上述结果一致，免疫细胞化学和流式细胞术显示，在1%氧气缺氧条件下，小胶质细胞中半凝集素-9的表达明显高于20%氧气正常缺氧条件下的小胶质细胞（图7B和C）。

为了进一步研究小胶质细胞半凝集素-9的表达是否受到缺氧的主要调节因子hif的调节，作者使用了髓细胞特异性Hif-1α-或Hif-2α-缺陷小鼠。作者收集gl26接种的LysM-Cre、LysM-Cre+/+/Hif-1α f/f和LysM-Cre+/+/Hif-2α f/f小鼠脑组织，比较半凝集素-9水平。在LysM-Cre和LysM-Cre+/+/Hif-1α f/f小鼠的组织中，半凝集素-9在同侧区域的表达明显高于对侧区域（图7D）。值得注意的是，Western blotting和免疫荧光染色显示，与LysM-Cre小鼠相比，LysM-Cre+/+/Hif-2α f/f小鼠同侧组织中半乳糖凝集素-9水平明显降低（图7D）。流式细胞术进一步显示，在LysM-Cre小鼠中，肿瘤浸润性CD45midCD11b+小胶质细胞上的半凝集素-9表达显著升高，但在LysM-Cre+/+/Hif-2α f/f小鼠中，这种升高明显降低（图7E）。此外，MRI和免疫组织化学分析显示，雄性和雌性LysM-Cre+/+/Hif-2α f/f小鼠的肿瘤体积明显小于LysM-Cre小鼠（图7F）

为了进一步证明Hif-2α依赖性半凝集素-9在小胶质细胞中的表达，作者使用原代胶质细胞进行了体外实验。与LysM-Cre对照小鼠相比，LysM-Cre+/+/Hif-2α f/f小鼠gl26cm暴露的胶质细胞中半乳糖凝集素-9水平明显降低（图7G）。此外，GL26CM对LysM-Cre小鼠小胶质细胞中半乳糖凝集素-9和PD-L1转录物的上调在LysM-Cre+/+/Hif-2α f/f小鼠中未见（图7H）。与小胶质细胞类似，敲除星形胶质细胞中的Hif-2α可显著抑制半乳糖凝集素-9的表达。此外，即使在正常条件下，GL26CM和rmGal-9也能提高Hif-2α转录水平。这些数据强烈表明，Hif-2α在调节脑TME内胶质细胞的半乳糖凝集素-9中起着重要作用。

图7 Hif-2α调控脑TME中半凝集素-9的表达

结论：

基于这些临床相关结果和作者的发现，作者提出半乳糖凝集素-9作为小胶质细胞的关键免疫检查点分子，影响脑TME的免疫和炎症反应。这个研究结果表明，将半乳糖凝集素-9靶向于髓系细胞可能是一种有希望的策略，可以改善基于icb的免疫治疗，克服脑肿瘤的治疗无反应性和耐药性。

实验方法：

颅内脑肿瘤模型，脑浸润细胞的分离，原代小胶质细胞的培养，条件培养基的制备，免疫印迹和RT-PCR分析，免疫荧光成像，流式细胞术，程序性细胞死亡实验，胶质细胞与CD8+ T细胞共培养实验

参考文献：

Chanju Lee, Dahee Yu, Hyung-Seok Kim, Ki Sun Kim, Chi Young Chang, Hee Jung Yoon, Su Bin Won, Dae Yeon Kim, Eun Ah Goh, Yong Sun Lee, Jong-Bae Park, Sang Soo Kim, Eun Jung Park; Galectin-9 Mediates the Functions of Microglia in the Hypoxic Brain Tumor Microenvironment. Cancer Res 15 November 2024; 84 (22): 3788–3802. https://doi.org/10.1158/0008-5472.CAN-23-3878