YAP1抑制诱导前列腺癌相关成纤维细胞表型转换为肿瘤抑制

前列腺癌很少对免疫检查点阻断（ICB）治疗有反应。癌症相关成纤维细胞（CAF）是免疫“冷”肿瘤微环境的关键组成部分，被认为是增强免疫治疗反应的有希望的靶点。在本研究中，作者旨在揭示调节CAF可塑性的机制，以确定将CAF从致蛋白表型转变为抗肿瘤表型的潜在策略，并增强ICB在前列腺癌中的疗效。整合四个前列腺癌单细胞RNA测序数据集定义了致蛋白和抗肿瘤的CAF， RNA-seq、流式细胞术和前列腺癌类器官模型证明了两种CAF亚型的功能。细胞外基质相关的CAFs （ECM-CAF）促进胶原沉积和癌细胞进展，淋巴细胞相关的CAFs （Lym-CAF）表现出抗肿瘤表型并诱导CD8+ T细胞的浸润和活化。YAP1活性调节ECM-CAF表型，YAP1沉默促进向lym - caf的转换。NF-κB p65是Lym-CAF亚群的核心转录因子，YAP1抑制p65的核易位。体内ECM-CAFs中选择性缺失YAP1可促进CD8+ t细胞浸润活化，增强抗PD-1治疗前列腺癌的治疗效果。总的来说，本研究揭示了前列腺癌中调节CAF身份的机制，并强调了改变CAF亚型以抑制肿瘤生长和增加对ICB敏感性的治疗策略。该文章于2024年 月发表于《Cancer Research》，IF：12.5。

摘要图：

主要研究结果：

1. 前列腺癌中ECM-CAF和Lym-CAF的鉴定

作者通过结合来自33例患者的37例前列腺癌样本的scRNA-seq数据集，研究了前列腺癌TME的免疫抑制性质（图1A）。进一步分析显示，这些caf被分成6个簇（图1B）。作者进行了差异基因表达分析，并确定了每种CAF亚型的特征标记（图1C）。作者通过Gene Ontology分析研究了6个簇之间CAF功能的差异，发现两个簇具有不同的功能：c3CAFs与胶原纤维组织高度相关，c5CAFs与白细胞迁移和炎症反应调节相关（图1D）。作者进一步研究了这两种亚型，通过FACS从人前列腺癌中分离c3CAFs与特征标记CD248（也称为内毒素）和c5CAFs与标记TSG6[肿瘤坏死因子α诱导蛋白6 （TNFAIP6）]，并进行RNA-seq分析（图1E）。这些分析表明，c3CAFs在CD248、I型胶原α 1链（COL1A1）、COL1A2、钙钙蛋白1 （CNN1）和细胞通信网络因子2 （CCN2）中高度富集，而c5CAFs在TNFAIP6、IL33、CXCL8、CXCL9、CXCL10和CXCL11中高度富集（图1F）。基于它们的功能和特征基因，作者将c3CAFs命名为“ecm相关CAF”（ECM-CAF），将c5CAFs命名为“淋巴细胞相关CAF”（Lym-CAF）。

通过对RNA-seq数据的基因本体分析，比较了ECM-CAF和Lym-CAF的主要功能。作者发现ECM- caf与ECM组织相关，而Lym-CAF与免疫反应和白细胞活化相关，这与scRNA-seq数据库结果一致（图1G和H）。作者试图通过丰富每个亚型的通路来深入了解ECM- caf和Lym-CAF是如何被诱导的。基因集富集分析结果表明，ECM-CAF富集于tgf -β信号通路，而Lym-CAF富集于tnf -α和ifn -γ信号通路（Supplementary Fig. S1I和S1J）。作者推测ECM-CAF是由TGFβ刺激诱导的，而Lym-CAF是由TNFα/IFNγ联合刺激诱导的。因此，作者从前列腺癌患者身上分离出人原代caf，在外源细胞因子的培养基中培养48小时，作者使用定量PCR检测ECM-CAF和Lym-CAF的特征标记。结果证实，TGFβ刺激增加了ECM-CAF相关标志物的表达，因此作者称之为“诱导ECM-CAF”（i-ECM-CAF）。TNFα/IFNγ刺激增加了Lym-CAF相关标志物的表达，作者称之为“诱导Lym-CAF”（i-Lym-CAF；图1I和J）。这些结果揭示了ECM-CAF和Lym-CAF的功能，并鉴定了它们各自的特征标记。

图1 前列腺癌中ECM-CAF和Lym-CAF的鉴定

2. Lym-CAF通过NF-κB p65信号通路促进CD8+ T细胞的活化

为了验证ECM-CAF和Lym-CAF在体内的功能，作者设计了一个肿瘤同源移植实验，将RM-1和预诱导的caf共注射（图2A）。首先，作者分离小鼠前列腺基质细胞，并在TGFβ或TNFα/IFNγ刺激下培养，以诱导ECM-CAF或lim - caf表型。然后，作者将前列腺癌细胞RM-1混合预诱导的cas皮下植入肿瘤同种移植物。值得注意的是，这两种CAF亚型表现出相反的生物学效应。RM-1细胞与i-ECM-CAF混合可显著促进前列腺癌的生长。然而，与对照CAF相比，i-Lym-CAF抑制肿瘤生长（图2B和C）。作者使用流式细胞术检测CD8+ T细胞的浸润情况，并评估CD25、CD69、颗粒酶B（Gra B）和IFNγ对CD8+ T细胞的激活作用。结果显示，i-Lym-CAF增加了CD8+ T细胞的浸润和活化（图2D-H）。作者进一步分析了Lym-CAF在TCGA数据集中的临床意义。结果强调，较高的Lym-CAF比例产生较高的ESTIMATE免疫评分，无进展间期生存分析证实，较高的Lym-CAF比例与较好的预后相关。

图2 Lym-CAF通过NF-κB p65信号通路促进CD8+ T细胞的活化

TNFα和IFNγ主要由TME中的免疫细胞分泌。因此，作者将CAFs与从人PBMCs中获得的CD3+淋巴细胞共培养。共培养/不共培养48小时后，收集CAFs并进行RNA-seq分析。结果显示，与CD3+淋巴细胞共培养后，Lym-CAF的特征标记物TNFAIP6、IL33、CXCL10和CXCL11上调，表明诱导了Lym-CAF表型（图2I）。基因本体分析表明，与CD3+淋巴细胞共培养后，CAFs的免疫应答功能得到增强。为了研究Lym-CAF诱导的机制，作者使用了转录因子富集分析。作者发现，在与CD3+淋巴细胞共培养后，RELA （NF-κB p65）是lim - caf中表达上调最强烈的转录因子（图2J）。同样，scRNA-seq数据表明，RELA在Lym-CAF中特异性高表达。因此，作者通过免疫荧光染色检测了Lym-CAF在人前列腺癌病理切片中的特征，结果显示TSG6、p65和αSMA具有良好的共定位（图2K）。此外，作者验证了p65的核易位，作者的结果表明p65在i-Lym-CAF中被激活（图2L），这表明Lym-CAF通过NF-κB p65信号通路对CD8+ T细胞发挥激活作用。

在将i- lim - caf与CD3+淋巴细胞共培养之前，作者使用siRNA敲低p65在i-lim-caf中的表达。作者评估了p65在i-Lym-CAF中的敲除效率，并检测了CD3+淋巴细胞中的p65，以排除无意的沉默。共培养48h后，收集CD3+淋巴细胞，流式细胞术分析。作者评估了Gra B和CD25对CD8+ T细胞的激活作用，结果表明p65对Lym-CAF具有免疫激活作用（图2M-O）。作者还使用定量PCR检测了CXCL9/10/11在i-Lym-CAF中的表达，结果表明NF-κB p65对CXCL9/10/11的分泌至关重要。基于这些结果，作者证实了Lym-CAF具有抗肿瘤表型，并可能通过NF-κB p65信号通路激活CD8+ T细胞。

3. ECM-CAF促进胶原沉积和癌细胞进展

据报道，CAF对胶原和ECM的过度分泌和沉积有助于免疫上的“冷”TME。作者的研究同样揭示并鉴定了一种具有ECM组织特征的CAF亚型，ECM-CAF。如上所述，RM-1细胞与i-ECM-CAF混合可显著促进前列腺癌的生长。因此，作者进一步证明ECM-CAF通过马松染色和原子力显微镜（AFM；图3A和B）。TCGA数据集分析显示，ECM-CAF与ecm评分呈高度正相关，无进展间期生存分析显示，ECM-CAF比例高预后较差。同样，scRNA-seq数据表明，ECM-CAF高度表达ecm相关基因。

图3 ECM-CAF促进胶原沉积和癌细胞进展

据报道，YAP1对肝星状细胞激活具有转录控制作用。肝星状细胞的活化引起纤维生成，促进ecm相关基因的表达，一定程度上表现出ECM-CAF表型。因此，作者研究了YAP1在前列腺癌ECM-CAF中的作用及其机制。首先，scRNA-seq数据表明，YAP1在ECM-CAF中高表达。同样，作者通过免疫荧光染色检测了人类前列腺癌标本病理切片中的ECM-CAF特征，结果显示CD248、YAP1和αSMA具有良好的共定位（图3C）。其次，作者验证了YAP1的核易位，结果表明YAP1在i-ECM-CAF中被激活（图3D）。此外，作者通过分离和培养前列腺癌类器官来评估YAP1在体外ECM-CAF中的功能。作者将类器官与人诱导的ECM-CAF共培养，并证明caf，特别是i-ECM-CAF，显著促进了类器官的生长。值得注意的是，i-ECM-CAF增强了促瘤作用，而YAP1敲低逆转了i-ECM-CAF的促瘤作用（图3E）。作者还通过定量PCR研究了caf中ecm相关基因，发现YAP1沉默显著抑制了ecm相关基因，表明YAP1在ECM-CAF中发挥了ecm高分泌功能（图3F）。

作者利用前列腺癌患者的TMA进行多重免疫组化染色，探讨YAP1高表达在CAFs中的临床意义。结果表明，αSMA+ CAFs中YAP1高表达的患者总体生存预后较差，CD8+ T细胞浸润较低（图3G和H）。此外，αSMA+ CAFs中YAP1高表达的患者T分期、N分期、肿瘤分级和前列腺特异性抗原浓度较高（图3I-L），提示cas中的YAP1是一个具有临床意义的靶点。

4. YAP1是Lym-CAF和ECM-CAF之间交换的媒介

由于CAF具有吸引力的可塑性，作者研究了两种CAF亚型之间的联系。首先，作者对这六个CAF簇进行了伪时间分析，发现Lym-CAF可以分化为ECM-CAF。然后，作者分析了ECM-CAF和Lym-CAF的伪时间轨迹，作者的结果证实了这一轨迹，并表明YAP1的轨迹与ECM-CAF的转化是一致的，这表明YAP1是调节这两种CAF亚型之间转换的看门人（图4A）。

作者通过在预诱导的Lym-CAF中过表达组成性激活的YAP1S127A或沉默YAP1，证明了YAP1在这种转化中的作用。正如预期的那样，当YAP1过表达时，ECM-CAF表型增强，而YAP1在i-Lym-CAF中沉默时，Lym-CAF表型增强（图4B和C）。为了将ECM-CAF转化为Lym-CAF，作者在与CD3+ T细胞共培养之前，在预诱导的ECM-CAF中使用siRNA敲低YAP1。结果显示，YAP1在ECM-CAF中的沉默增加了lym-caf相关标记物的表达，最重要的是，增强了CD8+ T细胞的活化（图4D-F）。此外，作者通过ELISA验证了CXCL9/10/11的分泌，结果表明YAP1的缺失促进了CXCL9/10/11的分泌，这意味着在ECM-CAF中靶向YAP1的缺失可能促进T细胞的活化。

图4 YAP1是Lym-CAF和ECM-CAF之间切换的看门人

作者进一步研究了ECM-CAF和Lym-CAF表型转换的分子机制，YAP1和NF-κB p65分别是核心转录因子。作者检测了在TGFβ或TNFα/IFNγ刺激下YAP1和p65及其磷酸化形式。Western blotting和免疫荧光分析证实，在ECM-和Lym-CAF表型中，YAP1和p65在核易位方面是互斥的，并且分别占主导地位（图4G和H）。作者还注意到，通过双荧光素酶报告基因检测，YAP1沉默后，NF-κ b启动子的激活程度更高（图4I），这表明YAP1抑制NF-κ b途径的激活。为了进一步研究YAP1与NF-κB p65上游的经典抑制剂核因子κB激酶α （IKKα）的相互作用，作者检测了IKKα抑制剂。结果显示，YAP1显著抑制IKKα激活的NF-κB活性，表明YAP1可能通过抑制IKKα而不是直接抑制p65起作用（图4J和K）。因此，作者使用原代CAFs进行共免疫沉淀，结果显示YAP1可以直接结合IKKα（图4L）。YAP1敲低显著激活磷酸化ikk α/β。值得注意的是，YAP1的梯度过表达也减弱了磷酸化ikk α/β的表达。此外，磷酸化i -κ b被下调，使p65不会与i - κ b复合物分离，从而抑制核易位（图4M和N）。这些结果表明，YAP1通过与IKKα的直接相互作用抑制NF-κB p65的活化，抑制IKKα的磷酸化。因此，作者证明了YAP1是Lym-CAF和ECM-CAF之间切换的媒介（图4O）。

5. 靶向ECM-CAF的选择性YAP1缺失在体内可抑制肿瘤进展

接下来，作者证明了靶向ECM-CAF的选择性YAP1缺失可以在体内将ECM-CAF表型转换为抗肿瘤Lym-CAF。首先，作者选择CD248作为ECM-CAF的特征标记物，构建CD248 - creert2；Rosa26-LSL-tdTomato小鼠评价CD248的特异性。作者通过免疫荧光染色验证了CD248与COL1A1和αSMA的良好共定位，这表明CD248是特异性表达的，是ECM-CAF的潜在靶点。此外，作者构建了Cd248-CreERT2；Yap1flox/flox （cKO）小鼠，作者可以使用它莫西芬在ECM-CAF中实现选择性的YAP1消耗（图5A）。植入RM-1肿瘤同基因移植物后，作者发现靶向ECM-CAF的选择性YAP1缺失抑制了前列腺癌的进展（图5B和C）。流式细胞术分析显示CD8+ T细胞的浸润增加（图5D）。作者还观察到，衰竭标志物PD-1和CTLA4在cKO小鼠中减少（图5E）。同时，活化的标记物CD25、CD69、Gra B和IFNγ上调（图5F和G），这意味着ECM-CAF中YAP1的选择性缺失具有强大的肿瘤抑制作用，可以激活CD8+ T细胞的抗肿瘤功能。此外，作者进行了Masson染色和原子力显微镜形态作图，发现在选择性去除YAP1后，前列腺癌中的胶原沉积减少（图5H和I）。作者还在Cd248-CreERT2上植入了trump - c1肿瘤同基因移植物；Yap1flox/flox小鼠，结果表明，在ECM-CAF中选择性地缺失YAP1增加了CD8+ T细胞的浸润和活化，并表现出肿瘤抑制作用。为了排除他莫昔芬引起的免疫改变，作者分别用载体或他莫昔芬治疗Cd248-CreERT2小鼠。结果显示，他莫昔芬治疗后无明显变化。

图5 靶向ECM-CAF的选择性YAP1缺失在体内可抑制肿瘤进展

作者还在NCG小鼠上建立了人源化免疫重建模型，以彻底验证ca -选择性YAP1缺失的肿瘤抑制作用。如前所述，将免疫缺陷的NCG小鼠植入预激活的人pbmc。此外，作者将22Rv1细胞系与人原代预诱导的ECM-CAF混合使用，发现与上述动物模型一样，敲低ECM-CAF中的YAP1可以抑制肿瘤进展（图5J和K），并增加CD8+ T细胞的浸润（图5L）。这些动物模型表明，选择性YAP1缺失具有肿瘤抑制作用，并激活CD8+ T细胞的抗肿瘤功能。

6. 靶向ECM-CAF的选择性YAP1缺失可提高体内抗PD-1抗体的免疫治疗效果

图6 靶向ECM-CAF的选择性YAP1缺失可提高体内抗PD-1抗体的免疫治疗效果

基于其抗肿瘤作用，作者假设靶向ECM-CAF的选择性YAP1缺失可以提高ICB在前列腺癌中的疗效，并在一定程度上逆转冷TME的困境。因此，作者进行了抗PD-1联合治疗试验。作者用cKO小鼠模拟选择性YAP1耗竭。作者在移植RM-1肿瘤7天后给予抗PD-1抗体（图6A）。因此，cKO联合抗PD-1抗体治疗比单独使用cKO或抗PD-1抗体治疗效果更好（图6B和C）。此外，联合治疗促进CD8+ t细胞浸润，降低耗尽标志物PD-1的表达，促进激活标志物Gra B和IFNγ（图6D-F），从而显示出强大的肿瘤抑制功能和增强免疫激活反应。这些结果表明，靶向ECM-CAF的选择性YAP1耗尽是一种很有前景的策略，可以显著提高抗PD-1抗体的治疗效果，并可能在临床应用中有效。

总之，作者的工作揭示并鉴定了两种CAF亚型的特征标记：ECM-CAF是由TGFβ刺激和高分泌的ECM诱导的，表现出致瘤表型，而Lym-CAF是由淋巴细胞分泌的TNFα/IFNγ诱导的，表现出高分泌细胞因子的抗肿瘤表型。YAP1和NF-κB p65是它们各自的核心转录因子，YAP1和p65的相互作用导致ECM-CAF和Lym-CAF之间的表型转换。靶向ECM-CAF的选择性YAP1缺失可将原蛋白cas转换为抗肿瘤cas，增强抗PD-1抗体对前列腺癌的治疗效果。

结论：

作者的团队之前发现CD248主要在基质中表达，尤其是在大多数实体肿瘤的caf中，被认为是癌症治疗的理想靶点。在这项研究中，经过抗PD-1抗体治疗的选择性YAP1缺失小鼠在前列腺癌中显示出令人鼓舞的肿瘤限制作用。作者的团队将继续致力于针对cas的YAP1耗竭治疗策略，如抗体-药物偶联物和靶向cd248的纳米药物递送。

实验方法：

差异基因表达分析、基因本体分析、基因集富集分析、转录因子富集分析、单细胞RNA测序、RNA测序、免疫荧光染色、共免疫沉淀、双荧光素酶报告基因检测、Western Blot、细胞培养与CAF诱导、构建前列腺癌类器官模型、细胞共培养实验、流式细胞术、细胞功能实验、肿瘤异种移植模型、基因敲除小鼠模型、人源化免疫重建模型、HE染色、免疫组化和免疫荧光染色评估肿瘤组织中CAF亚型的分布和特征标记物的表达、H&E染色和AFM检测肿瘤组织中的胶原沉积情况

参考文献：

Song， Hongtao et al. “YAP1 Inhibition Induces Phenotype Switching of Cancer-Associated Fibroblasts to Tumor Suppressive in Prostate Cancer.” Cancer research vol. 84，22 （2024）： 3728-3742. doi：10.1158/0008-5472.CAN-24-0932