CircHipk3通过促进NLRP 3转录以及抑制自噬在巨噬细胞炎性坏死中发挥双重作用，进而诱导腹主动脉瘤形成

腹主动脉瘤（AAA）是一种严重的慢性炎症性疾病，可导致腹主动脉局部扩张超过正常直径的50%，可能引发血管破裂，导致高发病率和死亡率。目前已知 circRNA可调控巨噬细胞焦亡，进而促进AAA中的炎症与基质金属蛋白酶（MMP）活性协同作用，但circRNA在调节AAA中巨噬细胞焦亡的具体作用尚不明确。本研究旨在探讨巨噬细胞焦亡启动子circHipk3对AAA的贡献及其潜在机制。研究发现，与正常动脉相比，主动脉瘤中CircHipk3明显上调。在经circHipk3治疗的小鼠中，巨噬细胞焦亡促进了炎症与MMP合成的协同作用，显著加速了血管紧张素（Ang）II和猪胰弹性蛋白酶（PPE）酶诱导的AAA形成。机制方面，通过RNA纯化分离染色质表明，circHipk3通过与Stat3相互作用促进巨噬细胞焦亡，增加主动脉中的NLRP 3水平，并通过结合Snd 1促进Ptbp1 mRNA降解以抑制自噬。总之，该研究揭示了circHipk3在巨噬细胞焦亡中的重要作用，其通过双重机制诱导动脉瘤形成和进展。该研究于2024年11月发表在《Clinical and Translational Medicine》上，IF：7.9。

技术路线：

主要研究结果：

1. 人类腹主动脉瘤和血管紧张素II诱发的小鼠AAA中均观察到细胞焦亡标志物表达升高和纤维化增加

为了确定细胞焦亡是否在人类和小鼠动脉瘤中发挥作用，作者评估了细胞焦亡标志物，包括NLRP3、CASP1、GSDMD和IL-1β，并分析了人类主动脉瘤和小鼠AAA中的MMP2/9。此外，作者进行了Masson三色染色以观察胶原纤维的状况。从接受AAA切除术的患者身上采集了人体组织和相应的相邻AAA正常样本。Masson三色染色显示AAA患者主动脉中的胶原蛋白减弱。qPCR结果表明，细胞焦亡标志物NLRP3、CASP1和IL-1β的表达在人类AAA中显著上调。Western blotting结果显示，与非动脉瘤组织相比，诱导细胞外基质(ECM)降解的NLRP3、MMP2和MMP9在人和小鼠主动脉瘤组织中显著增加。在Ang II诱导的小鼠AAA中，Masson三色染色、qPCR和Western blotting实验的结果与人AAA样本的结果一致。免疫组化呈现NLRP3、CASP1、GSDMD和IL-1β的表达趋势。免疫组化用于检查人和小鼠AAA样本中NLRP3、CASP1、GSDMD和IL-1β的表达趋势。结果显示，在人和小鼠AAA中，这些与细胞焦亡相关的关键蛋白的表达水平均上调。总的来说，研究结果表明增强的细胞焦亡与AAA的病理进展之间存在潜在关联。

2. CircHipk人类和小鼠AAA组织表达增加

CirHipk3是一个1099bp的环状RNA，来源于Hipk3基因外显子2，位于2号染色体(qE2)，如circBank(http://www.circbank.cn/;mmu_circ_0001052;图1A)中所述。图1B说明了circHipk3的三维结构。首先，作者证实circHipk3比线性转录本更稳定(图1C)。进行免疫荧光染色(图1D)并使用定量实时PCR从巨噬细胞中分离细胞质和核RNA(图1E)以确定circHipk3的亚细胞分布。结果表明circHipk3主要位于巨噬细胞的细胞质中。

接下来，为了验证circHipk3参与AAA形成的病理过程，作者检测了人AAA和小鼠AAA中circHipk3的表达情况。qPCR检测和ISH结果均表明，人AAA组织中circHipk3的表达明显高于邻近的非动脉瘤组织（图1F，G）。如前所述，作者建立了AngII诱导的小鼠AAA模型和PPE诱导的小鼠AAA模型，以及两者的对照，以研究AAA组和对照组小鼠主动脉circHipk3表达水平的不同。总体而言，与对照组小鼠相比，AAA模型小鼠的腹主动脉凸起更明显，表明成功建立了广为接受的AAA模型类型（图1H）。qPCR和ISH鉴定出AngII和PPE诱导的AAA模型小鼠中circHipk3的表达水平明显高于野生型对照小鼠（图1H-M）。此外，作者检测了ApoE−/−和C57BL/6J小鼠不同器官和组织中circHipk3的表达，发现qPCR检测显示circHipk3在主动脉中最丰富（图1N）。作者进一步评估了人和小鼠AAA组织中circHipk3与细胞焦亡标志物NLRP3、CASP1和IL-1β表达之间的相关性。结果表明，在人AAA组织中，circHipk3的表达与NLRP3和IL-1β的表达呈正相关。虽然circHipk3和CASP1之间存在正相关的趋势，但并未达到统计学意义。类似地，在小鼠AAA样本中，circHipk3表达与NLRP3和CASP1表达呈正相关。然而，circHipk3和IL-1β之间呈正相关的趋势未达到统计学意义。这表明circHipk3可能与细胞焦亡有关，并可能参与调节AAA的病理过程。此外，为了阐明AAA中circHipk3的细胞来源，作者对人和鼠样本进行了circHipk3与巨噬细胞标志物CD68和平滑肌细胞标志物α-SM-actin的免疫荧光共染色。作者的研究结果显示，在正常小鼠主动脉中circHipk3的表达极少，α-SM-actin的表达较高，表明没有共定位，并且没有CD68表达。在AngII诱导的小鼠AAA中，circHipk3和CD68的表达均显著增加，且存在显著的共定位，而α-SMactin表达显著降低，重叠最小。在PPE诱导的小鼠AAA中也观察到了类似的情况。与小鼠数据一致，人类无病主动脉(NDA)和AAA样本显示出可比的结果。上述结果表明，小鼠AAA中的circHipk3主要来源于巨噬细胞，并且可能主要在这些细胞内发挥其功能。

图 1 人类和小鼠腹主动脉瘤(AAA)组织中circHipk3表达增加

3. CircHipk3促进巨噬细胞焦亡

为了检验巨噬细胞是否是导致AAA发生和发展的主要细胞亚群，并确定在AAA的背景下，细胞焦亡是否主要发生在这些巨噬细胞中。作者从健康小鼠和用弹性蛋白酶治疗14天以诱发动脉瘤的小鼠的IAA（GSE152583，PMID：32678909）中获取了scRNA-seq数据。在对scRNA-seq数据集进行质量控制、数据整合、降维和聚类后，作者根据标记基因手动识别了3017个细胞中的九种不同细胞类型（图2A、B）。结果表明，与假手术组相比，AAA组的巨噬细胞百分比显著增加（图2C）。选择通过平均对数（倍数变化）确定的每种细胞类型的前五个特定标记基因，以将每种细胞类型与所有其他细胞类型区分开来（图2D）。此外，通过UMAP和小提琴图可视化，作者观察到与假手术组相比，弹性蛋白酶14 d组的巨噬细胞亚群中，细胞焦亡标志基因NLRP3、CASP1和GSDMD选择性上调（图2E）。作者的研究结果表明巨噬细胞作为细胞焦亡的主要细胞，参与了AAA细胞焦亡的病理过程。进一步探讨circHipk3在巨噬细胞中的生理作用。

在细胞实验中，作者用LPS诱导巨噬细胞发生细胞焦亡。首先，为了进一步确认circHipk3是否除了巨噬细胞外还在血管平滑肌细胞（VSMC）中发挥作用，作者检查了circHipk3在VSMC中的定位、其对细胞焦亡的影响以及其相对含量。作者发现circHipk3也主要位于细胞质中，可以促进VSMC中细胞焦亡标志物NLRP3的表达，但与巨噬细胞相比，其在VSMC中的表达较低，这表明circHipk3主要不在VSMC中起作用。在后续的细胞实验中，作者发现在LPS诱导的细胞焦亡基础上，敲低circHipk3降低了qPCR检测到的NLRP3、CASP1、IL-1β和IL-18的mRNA水平（图2F）。透射电子显微镜显示LPS刺激的巨噬细胞具有指示细胞焦亡的特征，包括：(1)细胞肿胀和细胞内细胞器破坏，(2)大量囊泡和细胞碎片释放，(3)染色质凝聚和核膜破裂。敲低circHipk3后，这些细胞焦亡的形态特征减弱。在染色质染色实验（TUNEL）中，敲低circHipk3导致巨噬细胞凋亡减少。免疫荧光染色显示，敲低circHipk3可降低LPS刺激后巨噬细胞焦亡标志物CASP1和NLRP3的激活（图2G，H）。此外，敲低circHipk3可降低PI染色评估的巨噬细胞坏死率（图2I）。同样，当circHipk3被敲低时，NLRP3、clCASP1、GSDMD-N、IL-1β和IL-18的蛋白质印迹结果也相似（图2J）。总之，结果表明巨噬细胞在AAA焦亡中起主导作用，而circHipk3可以促进巨噬细胞焦亡。

图 2 circHipk3促进巨噬细胞焦亡。骨髓来源的巨噬细胞(BMDM)用si-SCR或circHipk3小干扰RNA片段转染24 h，然后用浓度为 500 ng/mL 的脂多糖 (LPS) 处理另外24 h

4. 敲低circHipk3可抑制ApoE−/−小鼠中AngII诱导的AAA形成，而过表达circHipk3可促进AngII诱导的C57BL/6J小鼠中AAA形成

为了进一步明确circHipk3是否参与AAA的发生发展，作者采用携带circHipk3敲除构建体的AAV-9（sh-circHipk3）或携带circHipk3过表达构建体的AAV-9（AAVcircHipk3）以及相应的假病毒对照组（(AAV)-SCR-RNA/AAV-mScarlet）进行功能获得和丧失实验。免疫荧光证实circHipk3过表达或敲低构建体成功整合到主动脉壁中。qPCR证实circHipk3过表达或circHipk3敲低组小鼠主动脉中circHipk3水平上调或下调。宏观观察发现，sh-circHipk3小鼠腹主动脉膨大明显小于SCR-RNA组转染的apoE−/−小鼠（图3A）。同样，超声成像也显示出同样的趋势（图3B）。与SCR-RNA组相比，敲低circHipk3可以降低AAA的发生率（图3C），而sh-circHipk3组的破裂率和主动脉最大直径降低（图3D，E），表明circHipk3可以促进AAA形成。作者进一步观察了circHipk3是否通过促进细胞焦亡和ECM降解来诱导AAA形成。与作者的假设一致，弹性纤维染色（EVG）显示敲低circHipk3可以抑制AngII诱导的弹性蛋白降解，胶原纤维染色（Masson）显示sh-circHipk3组小鼠的纤维化较少（图3F，G）。免疫组化染色显示，在sh-circHipk3小鼠中，巨噬细胞标志物CD68、细胞焦亡标志物NLRP3、CASP1和金属蛋白酶MMP2和MMP9的表达显着降低（图3H-L）。Western印迹结果表明，敲低circHipk3可降低小鼠主动脉中NLRP3、GSDMD-N、cleavedCASP1、IL-18、IL-1β、MMP2和MMP9的表达水平（图3M）。相反，与AAV-mScarlet组相比，在受AngII刺激的C57BL/6J小鼠中过表达circHipk3可促进AAA形成（图4A），而超声成像（图4B）、AAA发生率（图4C）、AAA破裂率（图4D）和最大主动脉直径（图4E），反映AAA病变严重程度的circHipk3在AAV-mScarlet组中增加。与这些结果一致，过表达circHipk3促进了AngII诱导的弹性蛋白降解（图4F），AAV-circHipk3小鼠表现出更多的纤维化（图4G）。免疫组织化学显示，过表达circHipk3上调了巨噬细胞标志物CD68、细胞焦亡标志物NLRP3、CASP1、金属蛋白酶MMP2和MMP9的表达（图4H-L）。Westernblot结果显示，过表达circHipk3显着增加了细胞焦亡标志物NLRP3、GSDMDN、cleavedCASP1、IL-18、IL-1β、金属蛋白酶MMP2和MMP9的表达（图4M）。根据这些结果，circHipk3足以通过促进巨噬细胞焦亡来引发AAA，随后触发炎性细胞因子分泌和ECM降解。为了进一步阐明circHipk3在AAA内巨噬细胞中的作用，作者生成了HBAAV2/2-F4/80病毒，该病毒含有驱动circHipk3表达的巨噬细胞特异性启动子。在确认主动脉巨噬细胞成功转导并评估转导效率后，作者观察到在针对腹主动脉的巨噬细胞中特异性过表达circHipk3导致AAA病变大小增加，NLRP3表达上调。表明circHipk3在巨噬细胞焦亡中起重要作用，并影响AAA的进展。

图 3 敲低circHipk3可抑制Ang II诱导的AAA形成并降低与细胞焦亡和金属蛋白酶相关的炎症分子的水平

图 4 circHipk3的过度表达促进Ang II诱导的AAA形成并增加与细胞焦亡和金属蛋白酶相关的炎症分子的水平

5. 敲低circHipk3可抑制C57BL/6J小鼠中PPE诱导的AAA形成，而过表达circHipk3可促进C57BL/6J小鼠中PPE诱导的AAA形成

为了探索circHipk3对AAA形成的潜在影响是否独立于AngII，并考虑到所用动物模型和病毒感染模式的可能影响，作者扩展了研究范围，使用PPE诱导的AAA模型和ADV干预技术深入研究circHipk3在AAA发展中的作用。免疫荧光证实circHipk3过表达或敲低构建体成功整合到主动脉壁中。qPCR证实circHipk3过表达或circHipk3敲低组小鼠主动脉中circHipk3水平上调或下调。将PPE应用于小鼠肾下主动脉外膜2周后，结果显示，宏观上，sh-circHipk3组小鼠腹主动脉凸起不明显，而SCR-RNA组小鼠则无此表现（图5A）。此外，sh-circHipk3组小鼠腹主动脉最大直径减小（图5B）。弹性纤维（EVG）染色显示，shcircHipk3组小鼠弹性蛋白的降解程度较SCR-RNA组轻（图5C）。胶原纤维染色（Masson）结果显示，sh-circHipk3组小鼠纤维化程度较低（图5D）。免疫组织化学染色显示，当敲低circHipk3时，巨噬细胞标志物CD68、细胞焦亡标志物NLRP3、CASP1和金属蛋白酶MMP2和MMP9表现出与AngII诱导的AAA中观察到的趋势相同的趋势（图5E-I）。此外，Westernblot结果显示，敲低circHipk3可降低PPE诱导的AAA中NLRP3、GSDMD-N、cl-CASP1、IL-18、IL-1β、MMP2和MMP9的表达（图5J）。

相反，从宏观上看，与ADVmScarlet组相比，C57BL/6J小鼠中circHipk3的过表达导致PPE诱导下的AAA扩张更显著（图6A）。ADV-circHipk3组的最大主动脉直径增加（图6B）。此外，circHipk3的过表达促进了PPE诱导的弹性蛋白降解（图6C），AAV-circHipk3小鼠表现出更多的纤维化（图6D）。免疫组织化学显示，circHipk3的过表达上调了巨噬细胞标志物CD68、细胞焦亡标志物NLRP3、裂解CASP1、金属蛋白酶MMP2和MMP9的表达（图6E-I）。Westernblot结果显示，过表达circHipk3可显著增加细胞焦亡标志物NLRP3、GSDMDN、cl-CASP1、IL-18、IL-1β、金属蛋白酶MMP2和MMP9的表达（图6J）。总体而言，在PPE诱导的AAA中，circHipk3还会促进巨噬细胞焦亡，从而引发炎症因子的分泌和ECM的降解，加速AAA的进展。

图 5 敲低circHipk3可抑制猪胰腺弹性蛋白酶(PPE)诱导的AAA形成，并降低与细胞焦亡和金属蛋白酶相关的炎症分子水平

图 6 circHipk3的过度表达促进PPE诱导的AAA形成并增加与细胞焦亡和金属蛋白酶相关的炎症分子的水平

6. CircHipk3通过与Stat3相互作用促进巨噬细胞焦亡

接下来，作者进一步阐明circHipk3在巨噬细胞中发挥作用的潜在机制。作者进行了ChIRP分析并切除了circHipk3特异性带进行质谱分析（图7A）。在将circHipk3特异性结合蛋白与基因卡中的细胞焦亡相关基因重叠后，作者确定了10种重叠的细胞焦亡相关蛋白以供进一步分析（图7B）。随后，作者进行了进一步分析，以展示GSE51227（PMID：25358394）转录组数据集中10种重叠的细胞焦亡相关蛋白的差异表达。PCA显示AAA样本和对照明显分离成离散簇（图7C）。在10种重叠的细胞焦亡相关蛋白中，Stat3和Tlr2的表达水平在GSE51227数据集中不同（图7D，E）。所描绘的热图和差异表示图提供了令人信服的证据，表明Stat3和Tlr2在GSE51227数据集中表现出明显不同的表达水平（图7F、G）。qPCR证实Stat3和Tlr2水平在AAA中上调（图7H）。

作者选择Stat3作为潜在靶蛋白，因为它在激活NLRP3炎症小体中起上游作用，并已确定参与AAA的进展。根据catRAPID网站(http://service.tartaglialab.com/page/catrapid_group)的预测，circHipk3可能与Stat3相互作用(图7I)。此外，作者随后通过进行RIP测定证实了circHipk3和Stat3之间的相互作用，结果表明，与非特异性IgG抗体相比，抗Stat3抗体可使circHipk3富集(图7J)。发现Stat3与circHipk3特异性结合，这通过蛋白质印迹法得到验证(图7K)。根据Genotype-TissueExpression项目(https://gtexportal.org/home/)的表达数据，Stat3mRNA在主动脉和冠状动脉中高度表达(图8L)。Westernbolt的结果表明Stat3在人AAA中高表达(图8M)。接下来，作者研究了circHipk3和Stat3之间的相互作用是否影响Stat3水平。增强的circHipk3显着增加了巨噬细胞中的Stat3蛋白水平(图7N)。为了阐明circHipk3和Stat3相互作用的分子机制，作者使用蛋白质合成抑制剂环己酰亚胺(CHX)处理了circHipk3敲低的巨噬细胞。值得注意的是，与对照巨噬细胞相比，circHipk3敲低的巨噬细胞中Stat3的半衰期显着缩短，这表明circHipk3对Stat3降解具有延缓作用。(图7O)。接下来，作者进一步探讨了Stat3的过表达是否影响NLRP3和IL-1β以及IL-18的蛋白质表达水平。作者的相关性分析表明，在细胞焦亡关键基因中，NLRP3与Stat3的关联程度最高（图7P、Q）。先前的研究表明，Stat3能够结合NLRP3启动子并增强H3K9乙酰化和NLRP3转录，以及NLRP3/CASP1介导的细胞焦亡。19–23Stat3的过表达上调了NLRP3、IL-1β和IL-18的蛋白质表达水平（图7R–U）。此外，为了证明Stat3促进IL-1β和IL-18的成熟，作者评估了过表达Stat3的巨噬细胞中IL-1β和IL-18的RNA水平，并使用ELISA测量细胞上清液中成熟的IL-1β和IL-18的水平。作者的研究结果表明，Stat3的过表达显著上调了巨噬细胞中的RNA水平以及ELISA检测的上清液中IL-1β和IL-18的水平。circHipk3的过表达增强了NLRP3、IL-1β和IL-18的表达；然而，这种影响被Stat3的敲低所消除。总之，上述结果表明circHipk3通过Stat3-NLRP3-IL-1β/IL-18通路调节巨噬细胞焦亡。

图 7 CircHipk3通过与Stat3相互作用促进巨噬细胞焦亡

图 8 CircHipk3通过促进Ptbp1 mRNA降解来抑制自噬，从而促进巨噬细胞焦亡

7. CircHipk3通过促进Ptbp1mRNA降解来抑制自噬，从而促进巨噬细胞焦亡

先前研究表明，细胞内自噬在清除过量的NLRP3炎症小体中起着关键作用，自噬的减弱会导致NLRP3炎症小体的积累。24–26此外，研究表明circHipk3抑制自噬的形成。27–29作者观察到过表达circHipk3会抑制自噬相关蛋白Atg5和Beclin1的表达(图8A，B)。相反，敲低circHipk3会促进自噬形成，免疫荧光分析和自噬通量增加(图8C)都证明了这一点。此外，作者用透射电子显微镜观察到敲低circHipk3后巨噬细胞的自噬小体显著增加，表明circHipk3对自噬有抑制作用。使用维恩图方法，作者确定了Ptbp1和Snd1是与自噬调节相关的circHipk3下游靶点（图8D）。RIP测定证实了Snd1和Ptbp1与circHipk3的特异性结合，随后的蛋白质印迹法也证实了这一点（图8E-G）。生物信息学预测、qPCR和蛋白质印迹分析进一步证实了AAA条件下Ptbp1和Snd1水平升高（图8H-J）。值得注意的是，circHipk3的过表达与Ptbp1表达增加有关，表明circHipk3水平与Ptbp1稳定性呈正相关。为了探索circHipk3和Ptbp1相互作用的分子机制，先前的研究发现circRNA可以影响Ptbp1mRNA的稳定性。作者研究了circHipk3是否会影响Ptbp1mRNA的稳定性并介导Ptbp1的表达。使用放线菌素D和二甲基亚砜(DMSO)抑制RNA合成的实验表明，circHipk3会随时间破坏Ptbp1mRNA的稳定性(图8K)。对Snd1作用的进一步研究表明，它显著影响BMDM中Ptbp1mRNA的半衰期(图8L、M)。这使作者假设Snd1促进了circHipk3和Ptbp1mRNA之间的相互作用，从而增强了Ptbp1的稳定性。在BMDM中敲低Snd1后进行的RNA下拉分析证实了circHipk3探针对Ptbp1mRNA的富集减少，突出了Snd1对circHipk3和Ptbp1-3'UTR结合能力的影响(图8N)。此外，在过表达circHipk3后，作者观察到自噬蛋白Beclin1水平下降。然而，当作者过表达Ptbp1时，这种影响被逆转了。总之，作者的研究结果表明Snd1可能通过调节circHipk3和Ptbp1RNA分子之间的相互作用来调节Ptbp1mRNA水平。

结论：

总之，研究结果表明，circHipk3在促进细胞因子分泌和MMP合成的协同作用中起着关键作用，从而加剧了巨噬细胞焦亡并有助于AAA的形成。从机制上讲，circHipk3通过与Stat3相互作用，增加主动脉中的NLRP 3水平，并通过结合Snd 1促进Ptbp1 mRNA降解以抑制自噬，从而促进巨噬细胞焦亡来增强这种协同效应。鉴于其在AAA发病机制中的中心参与，circHipk3成为减轻AAA形成和破裂的有希望的治疗靶点。旨在调节circHipk3水平或活性的努力有可能预防和管理这种使人衰弱的血管疾病。

实验方法：

qRT-PCR、WB、IF、RNA原位杂交、超声成像、ChIRP、碘化丙啶染色、TUNEL染色、ELISA、细胞培养、转染及处理、建立小鼠疾病模型

参考文献：

Cai D, Li C, Zhang Y, et al. CircHipk3 serves a dual role in macrophage pyroptosis by promoting NLRP3 transcription and inhibition of autophagy to induce abdominal aortic aneurysm formation. Clin Transl Med. 2024;14(12):e70102. doi:10.1002/ctm2.70102