国自然热点-线粒体自噬文章精讲

尽管线粒体自噬在2型糖尿病（T2DM）引起的糖尿病心肌病（DCM）发病机制中的确切作用仍存在争议，但近期研究表明，线粒体自噬的抑制会加重DCM中的心脏损伤。已有报道指出，高糖环境下心肌细胞中的锌转运蛋白ZIP7表达上调，而在缺血/再灌注情况下，ZIP7的上调会导致小鼠心脏中线粒体自噬受到抑制。然而，关于ZIP7在T2DM引起的DCM中的作用及其与线粒体自噬的关系，目前了解甚少。在T2DM小鼠心脏中，ZIP7表达上调，而ZIP7条件性敲除（cKO）减少了T2DM小鼠心脏中的线粒体活性氧（ROS）生成。T2DM抑制了小鼠心脏中的线粒体自噬，而ZIP7 cKO则阻止了这种抑制。T2DM抑制了心脏线粒体中PINK1和Parkin的积累，而ZIP7 cKO则阻止了这种抑制作用，这表明ZIP7上调通过抑制PINK1/Parkin途径介导了T2DM诱导的线粒体自噬抑制。T2DM导致线粒体超极化并降低线粒体Zn²⁺含量，而ZIP7 cKO则阻止了这一现象，这表明ZIP7上调通过减少线粒体内的Zn²⁺导致线粒体超极化。最后，ZIP7 cKO阻止了T2DM引起的心脏功能障碍和纤维化。ZIP7上调通过抑制PINK1/Parkin途径，介导了T2DM对小鼠心脏中线粒体自噬的抑制。ZIP7上调导致的线粒体Zn²⁺减少，是PINK1/Parkin途径被抑制的原因。预防ZIP7上调对于治疗T2DM引起的心肌病至关重要。本文于2024年11月发表于“Cardiovascular Diabetology”（IF=8.5）上。

技术路线：

结果：

1）T2DM和高糖均上调ZIP7

为了测试ZIP7的表达是否会被T2DM改变，我们测量了其在小鼠心脏和心脏细胞中的蛋白表达。如图1A所示，ZIP7 mRNA和蛋白在T2DM小鼠心脏中的表达明显升高。同样，暴露于35 mM葡萄糖48小时的离体小鼠心肌细胞（图1B）、HL-1细胞（图1C）中ZIP7的表达也上调。这些结果表明ZIP7可能在T2DM诱导的心脏病中发挥作用。

2）T2DM小鼠心脏线粒体ROS升高，ZIP7的缺失降低了线粒体ROS

已有研究提出，线粒体活性氧（ROS）生成增加导致的氧化应激有助于糖尿病心肌病（DCM）的发病。因此，我们检测了2型糖尿病（T2DM）是否能改变心脏中线粒体ROS的生成，并确定了ZIP7在线粒体ROS生成中的作用。图2A（左）显示，与从野生型（WT）小鼠中分离的心肌细胞相比，T2DM小鼠的心肌细胞显示出更高的DHE荧光强度，这表明T2DM增强了心肌细胞的ROS生成。然而，心脏特异性ZIP7敲除（cKO）阻止了T2DM诱导的ROS生成，如DHE荧光强度降低所示（图2A），这表明ZIP7可能在T2DM诱导的心肌病中介导ROS生成。进一步的实验使用了Mitosox Red（一种线粒体超氧化物指示剂），结果显示T2DM增加了线粒体ROS的生成，而ZIP7 cKO逆转了这一效应（图2B），这表明ZIP7可能有助于T2DM引起的心脏线粒体ROS生成。为了证实这一发现，我们使用MitoB（一种线粒体靶向的光谱H2O2探针）在体内检测了小鼠心脏中的线粒体H2O2水平。图2C显示，与WT相比，T2DM心脏中的MitoP/MitoB比率显著增加，而ZIP7 cKO逆转了这一变化，这表明ZIP7介导了T2DM在小鼠心脏中诱导的线粒体H2O2生成。

3）ZIP7参与T2DM对线粒体自噬的抑制

功能失调的线粒体会触发ROS生成和线粒体损伤的恶性循环。线粒体自噬可以选择性地清除受损或功能失调的线粒体，从而防止线粒体ROS生成。因此，抑制或失活线粒体自噬会导致线粒体ROS生成增加。据此，我们检测了ZIP7是否通过控制线粒体自噬来介导T2DM引起的线粒体ROS生成增加。用高剂量葡萄糖（35mM）处理AC16细胞，不仅增加了ZIP7蛋白表达，还下调了自噬作用，表现为P62表达增加，而LC3II/I比率降低（图3A）。在小鼠心脏中，T2DM增加了P62、TOM22、TOM20和VDAC的蛋白表达水平，而ZIP7 cKO抑制了这一效应，这表明T2DM在体内通过ZIP7抑制小鼠心脏的线粒体自噬（图3B）。在从小鼠心脏分离的线粒体中，ZIP7 cKO也阻止了T2DM引起的LC3II减少（图3C）。为了确认ZIP7在T2DM背景下线粒体自噬中的作用，我们向小鼠注射了mitoQC质粒，并在心脏组织中检测其荧光强度。图3D显示，ZIP7 cKO在生理条件下或在T2DM背景下均增加了线粒体自噬。进一步的实验使用了mKeima（一种线粒体自噬的定量探针），结果表明T2DM下调了线粒体自噬，而ZIP7 cKO逆转了这一变化（图3E）。所有这些数据都表明，T2DM通过ZIP7抑制小鼠心脏的线粒体自噬。

4）ZIP7介导T2DM对线粒体中PINK1和Parkin积累的抑制

PINK1-Parkin通路在调节线粒体自噬过程中发挥着关键作用。为了探究ZIP7是否通过PINK1-Parkin通路介导2型糖尿病（T2DM）背景下的线粒体自噬抑制，我们检测了从小鼠心脏分离的线粒体内Parkin和PINK1蛋白的水平。与野生型（WT）相比，T2DM显著降低了线粒体内Parkin和PINK1蛋白的水平，而ZIP7条件性敲除（cKO）则逆转了这一效应，这表明ZIP7可能通过PINK1-Parkin通路介导T2DM诱导的线粒体自噬抑制（图4A）。为了证实这一发现，我们随后检测了PINK1 siRNA对活性氧（ROS）生成的影响。在注射siRNA后48小时，我们从心肌细胞中测量了ROS的水平。通过Western blotting评估了siRNA的有效性（图4B）。如上所述，ZIP7 cKO能够阻止T2DM诱导的ROS生成。然而，PINK1 siRNA逆转了cKO的这一效应，如二氢乙啶（DHE）荧光增强所示（图4C）。进一步的实验揭示，在cKOT2DM小鼠心肌细胞中，PINK1 siRNA显著增强了Mitosox Red的荧光强度，这表明ZIP7敲低通过PINK1减轻了T2DM诱导的线粒体ROS生成。因此，这一结果支持了上述发现，即ZIP7通过PINK1-Parkin通路介导T2DM诱导的线粒体自噬抑制。

5）ZIP7 cKO通过增加线粒体Zn2+来阻止T2DM诱导的小鼠心肌细胞线粒体超极化

为了探究2型糖尿病（T2DM）抑制Parkin招募入线粒体的机制，我们使用JC-1标记分离的小鼠心肌细胞，测定了线粒体膜电位（MMP）。如图5A所示，T2DM增加了JC-1的聚集体/单体比例，表明T2DM诱导了线粒体超极化。然而，ZIP7条件性敲除（cKO）逆转了T2DM的这一效应，暗示ZIP7是导致T2DM诱导的线粒体超极化的原因。为了支持这一观点，使用TMRE的额外实验也显示，ZIP7 cKO消除了T2DM诱导的超极化（图5B）。ZIP7定位于线粒体，其在线粒体中的上调会导致线粒体内Zn²⁺水平降低。由于Zn²⁺是阳离子，ZIP7上调导致的线粒体内Zn²⁺减少可能会引起线粒体超极化。因此，我们使用Zinpyr-1和Mitotracker在分离的小鼠心肌细胞中检测了线粒体Zn²⁺水平。图5C显示，T2DM降低了线粒体Zn²⁺水平，而ZIP7 cKO阻止了这种降低，表明ZIP7是导致T2DM引起线粒体Zn²⁺减少的原因。体外研究也表明，用35mM葡萄糖处理小鼠心肌细胞会降低线粒体Zn²⁺水平，而ZIP7 cKO逆转了这一效应（图5D）。为了证实这些发现，我们使用ICPOES测定了线粒体Zn²⁺水平。与上述定量数据一致，T2DM显著降低了线粒体Zn²⁺含量，而ZIP7 cKO阻止了这种降低（图5E）。为了验证所有这些发现，我们测定了线粒体ZIP7蛋白水平，并发现从T2DM小鼠心脏分离的线粒体中ZIP7表达显著增加（图5F），这表明线粒体中的ZIP7增加会通过促进Zn²⁺从线粒体流向胞质溶胶来降低线粒体Zn²⁺水平。

6）ZIP7 cKO对T2DM引起的心功能障碍和纤维化有预防作用

为了进一步证实ZIP7的作用，我们测试了ZIP7 cKO对T2DM条件下心功能、肥厚和纤维化的影响。超声心动图研究显示，T2DM可降低射血分数（EF）、分数缩短（FS）、左室舒张前壁厚度（LVAWD）和左室舒张后壁厚度（LVPWD），而ZIP7 cKO可抑制这一作用，提示ZIP7可解释T2DM诱导的心功能障碍（图6A）。HE染色的组织病理学研究显示，WT小鼠心肌细胞条纹清晰，排列规律（图6B，上面板）。相比之下，T2DM心肌细胞排列紊乱，细胞间隙增大，纤维断裂，ZIP7 cKO改善了这些，表明ZIP7与T2DM诱导的心肌损伤有关。Masson染色显示，与WT相比，T2DM心肌中胶原蛋白明显积累，ZIP7 cKO再次阻止了这种积累，提示ZIP7参与了T2DM诱导的纤维化。

结论：

ZIP7在糖尿病心肌病中发挥着关键作用，而抑制或失活ZIP7可能成为治疗T2DM所致糖尿病心肌病患者的有效治疗策略。

实验方法：

Western blotting，线粒体膜电位测定，DHE，线粒体自噬试验，HE染色，qPCR。

参考文献：

Yang N, Zhang R, Zhang H, Yu Y, Xu Z. ZIP7 contributes to the pathogenesis of diabetic cardiomyopathy by suppressing mitophagy in mouse hearts. Cardiovasc Diabetol. 2024 Nov 7;23(1):399. doi: 10.1186/s12933-024-02499-2.