国自然热点-SPP1+巨噬细胞

头颈部鳞状细胞癌（HNSCC）是一种非常侵袭性疾病，其特征是肿瘤免疫微环境（TIME）异质性。肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）是TIME中的主要天然免疫细胞群，它们参与恶性肿瘤进展中的关键调节过程。SPP1阳性巨噬细胞（SPP1 + Macs）在许多癌症中都有发现，但它们对头颈部鳞状细胞癌的影响尚不清楚。本研究旨在识别并验证SPP1 + Macs在头颈部鳞状细胞癌恶性进展中的作用和功能。单细胞RNA测序（scRNA-seq）结果显示，在头颈部鳞状细胞癌的肿瘤免疫微环境中，髓系细胞具有异质性，并且与肿瘤细胞强烈相关，并识别出了与头颈部鳞状细胞癌患者预后不良正相关的肿瘤特异性SPP1阳性巨噬细胞。GSVA表明，SPP1阳性巨噬细胞积极参与细胞因子的产生。Luminex液态悬浮芯片检测分析表明，SPP1阳性巨噬细胞来源的TNF-α和IL-1β起着重要作用。无论是在体外实验还是体内实验中，以及使用VGX-1027（一种抑制巨噬细胞来源的TNF-α和IL-1β的抑制剂）都证实了SPP1阳性巨噬细胞来源的TNF-α和IL-1β通过支持肿瘤细胞的增殖和迁移来促进头颈部鳞状细胞癌的进展。从机制上讲，，。此外，SPP1阳性巨噬细胞来源的TNF-α和IL-1β通过不同的信号通路促进了肿瘤细胞和其他邻近巨噬细胞中OPN的表达。SPP1阳性巨噬细胞可能是一个候选靶点，通过它能够增强抗肿瘤效果。本文于2024年12月发表于“J Exp Clin Cancer Res”（IF=11.4）上。

技术路线：

结果：

1）在HNSCC临床样本中鉴定出肿瘤特异性SPP1⁺ Macs

为了确定头颈部鳞状细胞癌（HNSCC）的细胞组成，我们收集了5对相邻的正常组织和肿瘤组织，并将其消化成单细胞悬液进行单细胞RNA测序分析（图1A）。经过质量控制和不纯细胞过滤后，保留了71,539个细胞的转录组进行后续分析。通过UMAP进行降维处理后，将这些细胞分为14个簇，然后归类为九种主要细胞类型（图1B，C），如下：上皮细胞，成纤维细胞，平滑肌细胞，内皮细胞，肥大细胞，髓系细胞，浆细胞和T细胞。所有五种患者的相邻正常组织和肿瘤组织中都存在这九种主要细胞类型。然而，每种细胞类型的浸润程度不同，这可能反映了头颈部鳞状细胞癌阶段的差异（图1D）。为了进一步探索头颈部鳞状细胞癌的肿瘤免疫微环境（TIME），我们比较了相邻正常组织和肿瘤组织之间免疫细胞和非免疫细胞的比例，并将免疫细胞分为五个亚群：B细胞（MS4A1和BANK1），肥大细胞（TPSAB1和CPA3），浆细胞（JCHAIN和TNFRSF17），髓系细胞（FPR3和MS4A4A）和T细胞（CD3D和CD3E）（图1E，F）。与每位患者的相邻正常组织相比，肿瘤组织中的髓系细胞、T细胞和肥大细胞的数量有所上调。在所有相邻正常组织中，髓系细胞大约占免疫细胞的14.32%，但在患者肿瘤组织中，它们的比例各不相同，平均占免疫细胞的26.42%（图1G）。肿瘤组织中髓系细胞的增加表明这些细胞可能与头颈部鳞状细胞癌的肿瘤进展有关。随后使用CellChat探索免疫细胞与上皮细胞之间的通讯。与相邻正常组织相比，肿瘤组织中髓系细胞与上皮细胞之间的相互作用明显不同（图1H）。因此，我们重点关注髓系细胞，并根据先前的研究将这些细胞分为七个亚群，其中cDC1s、cDC2s、pDCs和单核细胞分别以BIRC3、CD1C、GZMB和S100A8的高表达为特征。还识别出了三种不同的巨噬细胞亚群——SPP1+巨噬细胞、MNDA+巨噬细胞和IGKC+巨噬细胞（图1I，J）。有趣的是，MNDA+巨噬细胞和IGKC+巨噬细胞在相邻正常样本中富集，而SPP1+巨噬细胞在几乎所有肿瘤样本中都有所增加（图1I）。这些结果表明，SPP1+巨噬细胞可能在头颈部鳞状细胞癌的恶性进展中执行不同的功能。

2）肿瘤特异性SPP1⁺ Macs与HNSCC不良预后呈正相关

在研究了肿瘤和相邻正常组织之后，我们接下来调查了髓系细胞中SPP1的表达。火山图和UMAP图显示，SPP1在髓系细胞中显著上调，并且在巨噬细胞中高表达（图2A，B）。此外，SPP1+巨噬细胞在肿瘤组织中的髓系细胞总数中占49.77%，而在相邻正常组织的髓系细胞总数中仅占19.52%（图2C）。免疫组化染色（MIHC）揭示，SPP1与CD68+细胞显著共定位，并且SPP1在来源于头颈部鳞状细胞癌肿瘤组织的巨噬细胞中的表达高于来源于相邻正常组织的巨噬细胞（图2D，E）。SPP1在头颈部鳞状细胞癌肿瘤样本中的表达显著高于正常口腔上皮组织样本（图2F）。进一步分析发现，SPP1表达与TNM分期呈正相关（图2G）。此外，SPP1的曲线下面积（AUC）为0.8495，这表明SPP1可能是头颈部鳞状细胞癌的生物标志物（图2H）。SPP1表达较高的患者生存率较低（图2I）。对TCGA数据的分析揭示了相同的发现，这表明SPP1+巨噬细胞与不良预后相关，且SPP1表达水平与头颈部鳞状细胞癌患者的癌症分期和肿瘤等级呈正相关（图2J）。总的来说，这些结果表明SPP1在头颈部鳞状细胞癌中上调，并且主要在巨噬细胞中表达，这表明SPP1作为预后生物标志物的潜在价值。

3）SPP1⁺ Macs通过分泌细胞因子促进HNSCC进展

为了评估SPP1+巨噬细胞对头颈部鳞状细胞癌的生物学影响，我们将巨噬细胞分为两个亚群，SPP1+巨噬细胞和其他所有巨噬细胞，并基于单细胞RNA测序数据进行了GSVA。结果表明，与普通巨噬细胞相比，SPP1+巨噬细胞积极参与细胞因子的产生（图3A）。因此，我们假设SPP1+巨噬细胞可能通过分泌细胞因子促进头颈部鳞状细胞癌的进展。在这里，我们利用慢病毒转导在THP-1细胞中过表达或敲减SPP1。在用PMA处理48小时诱导THP-1细胞分化为巨噬细胞后，通过western blotting和实时PCR分别测量了THP-1细胞来源的巨噬细胞中SPP1的蛋白质和mRNA水平（图3B）。为了研究SPP1+巨噬细胞对头颈部鳞状细胞癌细胞的直接或间接影响，我们从SPP1阴性对照组（SPP1-NC；SPP1-NC THP-1细胞来源的巨噬细胞）和SPP1过表达组（SPP1-OE；SPP1-OE THP-1细胞来源的巨噬细胞）收集了细胞培养上清液，用于进一步的间接培养HN6和CAL27细胞，同时使用另一个共培养模型来探索直接影响（图3C）。与SPP1-NC相比，SPP1-OE在直接和间接培养系统中都促进了HN6和CAL27细胞的增殖，而直接共培养系统强烈加速了头颈部鳞状细胞癌细胞的生长（图3D，E）。SPP1-OE显著促进了HN6和CAL27细胞的迁移（图3F，G）。为了进一步探索SPP1+巨噬细胞释放哪些候选细胞因子作用于头颈部鳞状细胞癌细胞，我们使用了Luminex液相悬浮芯片检测来比较SPP1-NC组和SPP1-OE组之间40种常见趋化性和炎症性细胞因子的表达。与SPP1-NC组相比，SPP1-OE组中差异表达最高的5种细胞因子是MIF、CXCL8、CXCL5、TNF-α和IL-1β（图3H, I）。随后，我们使用ELISA测量了这些细胞因子在SPP1-NC组和SPP1-OE细胞组新鲜上清液中的浓度。结果表明，MIF、TNF-α和IL-1β是在SPP1-OE巨噬细胞中上调最显著且高表达的基因（图3J, K）。因此，在后续实验中，我们重点关注了这三种因素。

4）SPP1⁺ Mac衍生的TNF-α和IL-1β在体外加速HNSCC细胞的增殖和迁移

为了研究SPP1+巨噬细胞来源的TNF-α和IL-1β是否促进头颈部鳞状细胞癌细胞增殖，用添加TNF-α和IL-1β的巨噬细胞上清液或VGX-1027处理肿瘤细胞，比较巨噬细胞对肿瘤细胞的影响。MTT试验和共培养集落形成试验显示，与SPP1-NC细胞组相比，SPP1-NC + rhTNF-α、SPP1-NC + rhIL-1β和SPP1-NC + rhTNF-α + rhIL-1β细胞组显著增加了HN6和CAL27细胞的增殖（图4A, B）。随后，我们将VGX-1027添加到SPP1-NC和SPP1-OE组的上清液中以阻断TNF-α和IL-1β的效果，发现SPP1-OE组的增殖率显著降低，而SPP1-NC组的增殖率略有降低（图4C, D）。结果表明，抑制巨噬细胞来源的TNF-α和IL-1β减少了肿瘤细胞的生长，并且SPP1-NC也表现出TNF-α和IL-1β的分泌。同样，当与SPP1-KD细胞培养时，rhTNF-α和rhIL-1β促进了HNSCC细胞的生长（图4E, F），这表明TNF-α和IL-1β在SPP1+巨噬细胞中的功能与SPP1不同。伤口愈合和Transwell迁移试验显示，SPP1-NC+rhTNF-α、SPP1-NC+rhIL-1β、SPP1+rhTNF-α+rhIL-1β、SPP1-KD+rhTNF-α或SPP1-KD+rhIL-1β处理强烈加速了这些细胞的迁移，而VGX-1027处理显著减缓了HNSCC细胞的迁移（图4G, H）。这些结果共同表明，TNF-α和IL-1β可能在SPP1+巨噬细胞促进HNSCC细胞体外增殖和迁移的过程中发挥主要作用。

5）SPP1⁺ Macs分泌的TNF-α和IL-1β受NF-κB信号通路调控

在建立了SPP1+巨噬细胞与TNF-α和IL-1β之间的联系之后，我们接下来研究了它们分泌的机制。我们对单细胞RNA测序数据的GSVA揭示了SPP1+巨噬细胞与I kappa B/激酶nf-kappa B信号通路相关（图3A）。因此，我们研究了NF-kappa B信号通路是否影响SPP1+巨噬细胞分泌TNF-α和IL-1β。我们用PDTC（一种选择性的NF-kappa B抑制剂）预处理SPP1-NC和SPP1-OE巨噬细胞3小时，以评估SPP1-OE巨噬细胞的影响。与SPP1-NC巨噬细胞相比，SPP1-OE巨噬细胞表现出p65和IκBα的磷酸化增加以及IκBα表达的减少。PDTC处理减弱了p65和IκBα的磷酸化（图5A）。在SPP1-NC巨噬细胞中，p65主要定位于细胞质中，而在SPP1-OE巨噬细胞中，p65在细胞核中积累。经过PDTC预处理后，p65保持在细胞质中（图5B）。共聚焦显微镜的结果也证实了这些结果，并表明NF-kappa B信号通路可能在SPP1+巨噬细胞中被激活（图5C）。随后，我们使用ELISA来确定PDTC抑制巨噬细胞中的NF-kappa B信号是否减少了TNF-α和IL-1β的分泌。PDTC显著减少了SPP1-NC和SPP1-OE巨噬细胞分泌的TNF-α和IL-1β（图5D, E）。此外，MTT和Transwell迁移实验显示，用PDTC预处理巨噬细胞后，与这些巨噬细胞共培养的HN6和CAL27细胞的增殖和迁移被抑制（图5F, G）。总之，我们的发现表明，SPP1+巨噬细胞通过激活NF-kappa B信号通路增加了TNF-α和IL-1β的分泌。

6）SPP1⁺ Mac衍生的TNF-α和IL-1β促进巨噬细胞和肿瘤细胞中OPN的表达

为了进一步探索SPP1+巨噬细胞分泌的TNF-α和IL-1β如何促进头颈部鳞状细胞癌的进展，我们将重组人TNF-α（rhTNF-α）和重组人IL-1β（rhIL-1β）单独以及同时添加到HN6和CAL27肿瘤细胞中。先前的研究表明，TNF-α和IL-1β在不同细胞类型中激活PI3K/Akt、NF-κB、MAPK/Erk和STAT3信号通路。因此，我们检测了哪个信号通路与TNF-α和IL-1β调节肿瘤细胞的能力相关。Western blot分析显示，在HN6和CAL27细胞中，NF-κB信号通路被单独的TNF-α和IL-1β以及TNF-α和IL-1β共同激活（图6A）。此外，PDTC减少了TNF-α和IL-1β诱导的肿瘤细胞增殖和迁移能力的增加（图6B-E）。有趣的是，我们还观察到当肿瘤细胞用TNF-α或IL-1β处理时，OPN表达也会增加，而当它们同时用TNF-α和IL-1β处理时，显示出双重效果（图6A, F-G）。我们进一步使用流式细胞术检测表达，并使用PDTC抑制功能（图6G, H）。结果显示，TNF-α和IL-1β激活了NF-κB信号通路，然后促进了肿瘤细胞中OPN表达和肿瘤细胞进展。鉴于TNF-α和IL-1β促进了肿瘤细胞中OPN的表达，我们想知道TNF-α和IL-1β是否也促进邻近巨噬细胞中OPN的表达。当巨噬细胞用TNF-α或IL-1β单独处理或同时用TNF-α和IL-1β处理时，OPN在蛋白质和mRNA水平上的表达均上调（图6I）。然而，我们发现TNF-α和IL-1β在巨噬细胞中激活了STAT3，但没有激活NF-κB信号通路。在用TNF-α和IL-1β处理的巨噬细胞中使用Stattic（一种阻断STAT3的药物）减少了OPN表达（图6J-L）。简而言之，SPP1+巨噬细胞来源的TNF-α和IL-1β促进了巨噬细胞和肿瘤细胞中OPN的表达。

7）SPP1⁺ Macs促进HNSCC在体内的进展

为了进一步验证SPP1+巨噬细胞对体内头颈部鳞状细胞癌生长的影响，我们使用了HN6 HNSCC肿瘤细胞与从THP-1细胞分化的巨噬细胞按7:3比例混合的方法来建立小鼠模型。经过VGX-1027或PDTC处理3小时后，将SPP1-NC、SPP1-OE、SPP1-KD、SPP1-OE + VGX-1027或SPP1-OE + PDTC细胞组皮下注射到裸鼠中（图7A）。为了保持持久的效果，我们每隔3天围绕肿瘤注射VGX-1027和PDTC。有趣的是，SPP1-KD、SPP1-OE + VGX-1027和SPP1-OE + PDTC组的肿瘤重量和体积显著低于SPP1-NC组（图7B-D）。在取出移植肿瘤后，进行了IHC染色和多重免疫组化染色，以探索OPN、TNF-α和IL-1β的表达水平。两种染色结果均表明，SPP1-OE、SPP1-OE + VGX-1027和SPP1-OE + PDTC组的OPN表达高于其他组。我们还发现，SPP1-OE + PDTC组的OPN表达低于其他两组，这可能表明PDTC如我们之前所示抑制了肿瘤细胞中OPN的表达。TNF-α和IL-1β在SPP1-OE + VGX-1027和SPP1-OE + PDTC组的表达低于SPP1-OE组，甚至低于SPP1-NC组，此外，结果显示OPN、TNF-α和IL-1β在SPP1-KD组的表达最低（图7E, F）。总之，这些数据表明SPP1+巨噬细胞通过激活NF-kappa B信号通路分泌细胞因子TNF-α和IL-1β来促进HNSCC的进展。

结论：

SPP1阳性巨噬细胞激活NF-kappa B途径，增加TNF-α和IL-1β的分泌，这促进了头颈部鳞状细胞癌细胞的增殖和迁移。我们还证明了TNF-α和IL-1β在肿瘤细胞和巨噬细胞中上调了OPN的表达；因此，这些因素可能成为通过增强抗肿瘤效果来提高疗效的候选靶点。

实验方法：

单细胞测序，RT-PCR，Western blot，IHC，免疫荧光，mIHC，免疫细胞化学，芯片检测，ELISA，MTT，克隆形成实验，transwell，伤口愈合实验，流式。

参考文献：

Liu C, Wu K, Li C, Zhang Z, Zhai P, Guo H, Zhang J. SPP1+ macrophages promote head and neck squamous cell carcinoma progression by secreting TNF-α and IL-1β. J Exp Clin Cancer Res. 2024 Dec 26;43(1):332. doi: 10.1186/s13046-024-03255-w.