迁移体释放和靶向递送的细胞因子在炎症部位的快速积累

细胞因子是免疫细胞的关键效应分子，在身体对感染、炎症和创伤的反应中起着至关重要的作用。分泌的细胞因子通过扩散形成梯度，由近及远浓度逐渐降低。然而，在动态流动系统如血液中，建立局部梯度是具有挑战性的。迁移体（migrasomes）是在迁移细胞中形成的一种细胞器，富含细胞因子、趋化因子和生长因子等信号分子，可以被周围细胞捕获并影响和改变受体细胞的行为和状态。该研究阐述迁移体在循环系统中如何包装、释放和靶向递送细胞因子，揭示了迁移体在免疫反应中的重要作用。该文章于2024年12月发表在《Cell Discovery》，IF=20.91。

首先，研究者研究了单核细胞是否能在体内产生迁移体。在对照小鼠中，CCR2抗体标记的单核细胞几乎无法检测到；然而，在LPS刺激后，单核细胞在血管中清晰可见，并且形成了大量的CCR2阳性细胞外颗粒（图1a）。为了确定循环单核细胞是否在体内释放如TNF-α等细胞因子，研究者对血管内单核细胞中的TNF-α进行染色。活体成像显示TNF-α明显极化到CCR2阳性单核细胞的后端，并且在这些细胞外颗粒中显著富集（图1b）。随后，研究者通过负选择磁性分选从小鼠血液中分离出单核细胞来源的细胞外颗粒（图1c）。对于共聚焦成像分析，研究者首先用抗CCR2抗体涂覆盖玻片。该抗体涂覆的表面与单核细胞来源的细胞外颗粒孵育，随后洗涤和免疫染色（图1c）。通过这种方式，研究者捕获了CCR2阳性颗粒。CCR2阳性颗粒表现出迁移体的形态特征（图1d）。并且，在这些迁移体中检测到了TNF-α和IL-6（图1e，f）。

研究者发现，LPS激活原代的单核细胞产生了大量的迁移体。激活的单核细胞分泌TNF-α和IL-6，这两种细胞因子在先天免疫反应中发挥重要作用。用抗TNF-α和IL-6的抗体对LPS激活的单核细胞进行免疫染色显示，TNF-α以斑点形式存在于迁移体中，而IL-6则存在于迁移体内的腔内囊泡中。WB证实，LPS处理显著增强了细胞体和迁移体中TNF-α和IL-6的水平。此外，与细胞体相比，TNF-α和IL-6在迁移体中富集。接下来，研究者从细胞膜和迁移体中分离总膜蛋白。如预期的那样，膜结合的TNF-α在迁移体中显著富集。

综上所述，这些发现表明细胞因子在迁移体中富集。钙离子对细胞因子的胞吐至关重要。为了准确估计通过迁移体释放的细胞因子量，研究者用细胞渗透性钙螯合剂BAPTA-AM处理LPS刺激的单核细胞10小时。这种处理阻断了细胞体的细胞膜和迁移体膜的细胞因子胞吐。随后，研究者分别用TNF-α和IL-6抗体对细胞进行染色。研究者观察到，阻断胞吐显著增加了迁移体中的细胞因子量，但细胞体中的量没有增加。BAPTA-AM处理后，迁移体中的TNF-α和IL-6水平分别增加了14.6倍和10.9倍，而细胞体中仅分别增加了1.41倍和1.35倍（图1g，h），表明迁移体是细胞因子的主要分泌场所。

接下来，研究者测试了分泌载体是否在迁移体中富集。透射电子显微镜（TEM）识别出原代单核细胞来源迁移体内存在许多腔内囊泡。接下来，研究者使用针对分泌载体上各种标记物的抗体，包括Rabs、V-SNAREs和T-SNAREs。研究者的发现表明迁移体中存在几种分泌载体的关键标记物。这些包括与组成性胞吐相关的Rab8a和VAMP2，以及通过回收内质网与调节性分泌途径相关的Rab11a和VAMP3。此外，TSNARE SNAP23在迁移体膜中显著富集。同样，用BAPTA-AM处理细胞显著增加了迁移体中Rab8a、Rab11a、VAMP2和VAMP3标记的囊泡数量。这些数据表明分泌载体可以富集在迁移体中。

体内数据显示单核细胞向血液中释放富含TNF-α的迁移体。为了更详细地检查释放过程，研究者用荧光素偶联的抗TNF-α抗体标记PMA激活的THP-1细胞。这种抗体标记了细胞膜和一群细胞内囊泡。在不支持迁移的对照表面上，THP-1细胞显示出TNF-α囊泡的非极化分布，如延时成像所示。然而，在支持迁移和迁移体形成的纤维连接蛋白（FN）涂覆表面上，TNF-α囊泡明显极化到细胞后端并进入迁移体（图2a）。支持这一观察，L929细胞表达TNF-α-BFP或IL-6-GFP的活体成像显示，大多数TNF-α-BFP囊泡位于细胞后端，几乎没有囊泡位于前端。IL-6-GFP也显示出极化分布，尽管程度较小，大多数囊泡位于后端，几乎没有位于前缘（图2b，c）。然而，当细胞迁移和迁移体形成被迁移肽抑制剂GLPG0187抑制时，这种极化丢失。在这些条件下，TNF-α-BFP和IL-6-GFP囊泡在整个细胞中均匀分布（图2b，c）。值得注意的是，用BAPTA-AM处理阻断分泌显著增加了迁移体中TNF-α-GFP和IL-6-GFP的水平，而不影响细胞体中TNF-αGFP和IL-6-GFP的水平，进一步支持迁移体是迁移细胞中胞吐的主要场所。以上结果表明细胞迁移可以驱动分泌模式的转变，其特征是分泌囊泡向细胞后端的极化运输。

接下来，为确定静止细胞和迁移细胞中分泌的效率，研究者开发了一种新方法来定量总细胞分泌。这种方法需要收集培养基，通过超滤分离可溶性蛋白。同时，从相同的细胞培养皿中纯化迁移体，并引入裂解缓冲液以回收迁移体内的蛋白和滤器上的可溶性蛋白（图2d）。通过这种方法，研究者发现培养在促进迁移体形成的FN涂覆培养皿上的单核细胞显示出TNF-α和IL-6分泌分别增加了3.1倍和1.6倍，与培养在不支持迁移体形成的对照培养皿上的单核细胞相比（图2e）。重要的是，这种分泌差异不是由于不同培养条件引起的细胞因子表达水平的变化，因为细胞体内的TNF-α和IL-6水平在两种条件下保持一致（图2e）。总之，研究者的发现表明，当细胞开始迁移时，它们转变为与迁移相关的分泌模式。这一模式的特征是极化运输路线，显著提高了总体分泌水平，这一过程依赖于迁移体的形成（图2f）。

在研究者之前的研究中，研究者注意到四跨膜蛋白家族成员调节迁移体的形成。Tspan9基因敲除（T9 KO）小鼠的中性粒细胞显示出受损的迁移体生物合成。研究者观察到，从T9 KO小鼠分离的单核细胞中迁移体形成也受到损害。此外，研究者观察到WT小鼠的单核细胞显示出总TNF-α和IL-6分泌水平分别比T9 KO小鼠的单核细胞高出2.4倍和1.7倍（图3a）。这支持了研究者的假设，即迁移体在细胞因子释放中起核心作用。

为了研究Tspan9在单核细胞迁移体形成中的作用，研究者进行了三项检测，以比较WT和T9 KO小鼠血液中CCR2阳性、单核细胞来源颗粒的数量。首先，研究者从小鼠中分离单核细胞，然后用不同颜色标记的CCR2抗体进行标记。将颜色编码的细胞混合后，注入WT小鼠。与研究者在体外的观察相似，活体成像显示T9 KO小鼠的单核细胞在体内产生的迁移体较少（图3b）。接下来，为了直接比较WT和T9 KO小鼠血液中CCR2颗粒的水平，研究者使用多光谱成像流式细胞术定量循环CCR2颗粒。简而言之，在稀释后，全血用CCR2抗体染色以标记单核细胞和单核细胞来源结构，随后进行成像流式细胞术。成像分析表明，这些CCR2阳性颗粒是小囊泡，类似于研究者在体内观察到的单核细胞来源迁移体。多光谱成像流式细胞术显示T9 KO小鼠的血液中CCR2颗粒显著减少（图3c）。最后，研究者从小鼠中收集等体积的血液，将CCR2颗粒捕获在涂覆有CCR2抗体的表面上，并使用成像分析定量捕获的CCR2颗粒。一致地，研究者在T9 KO小鼠中观察到CCR2颗粒的减少（图3d）。

接下来，研究者从生化角度对单核细胞来源颗粒进行了表征。首先，研究者按照图1c中所示的示意图中的协议分离单核细胞来源颗粒。由于单核细胞来源迁移体是CCR2阳性，负选择过程将去除其他类型细胞产生的CCR2阳性颗粒。为了验证单核细胞来源的CCR2阳性颗粒是否显著受到其他类型细胞外囊泡（EVs）的污染，研究者评估了经典用于分析小EVs（包括在多泡内体中形成的外泌体和在细胞膜上形成的小ectosomes）和大EVs的标记物。研究者的发现表明CCR2颗粒没有显著受到其他EV类型的污染：CCR2颗粒几乎没有小EVs的标记物CD63、CD81和Alix，并且缺乏微囊泡标记物Arf6和Kif23（图3e）。同样，CCR2颗粒几乎不含与血小板或血小板来源EVs强相关的CD9（图3e）。相比之下，CCR2颗粒富含迁移体标记物CPQ（图3e）。这些发现表明，迁移体与其他类型EVs的主要区别在于迁移体含有分泌载体，这一特征在其他任何EVs中均未报道。因此，研究者将分泌载体的标记物，如VAMP2、VAMP3、Rab8a、Rab11a以及分泌细胞因子，如TNF-α和IL-6，作为迁移体的标记物。研究者发现这些蛋白确实富集在迁移体中，而不是在其他共分离的不同大小和密度的EVs中（图3e）。在随后的WB分析中，研究者从小鼠血液中分离出CCR2阳性颗粒，发现T9 KO小鼠显示出迁移体标记物的显著减少（图3f）。值得注意的是，在T9 KO小鼠中，与VAMP2、Rab8a和IL-6相比，VAMP3、Rab11a和TNF-α的减少更为显著，表明通过回收内质网的Rab11a调节的运输途径比Rab8a调节的组成性运输途径更特异性地导向迁移体。为了排除这些标记物减少是由于表达水平降低的可能性，研究者比较了从小鼠类型中分离的单核细胞中的蛋白表达水平。研究者的发现表明，T9 KO小鼠的单核细胞中这些蛋白的表达水平并未降低。总之，这些结果表明CCR2颗粒确实是迁移体，并且T9 KO小鼠的单核细胞中迁移体标记物的水平显著降低，这并非由于蛋白表达水平的降低。

接下来，研究者评估了迁移体在体内细胞因子分泌中的作用。这尤其重要，因为迁移体中释放的细胞因子可能无法通过标准方法如细胞因子阵列检测到。为此，研究者从小鼠中分离等体积的血液，提取单核细胞来源的迁移体，并使用超滤从血液中收集分泌蛋白。然后，研究者使用WB分析测量这些单核细胞来源迁移体（M）中的TNF-α和IL-6水平，以及可溶性分数（S）和合并样本（TS）中的水平（图3g）。研究者的结果表明，在WT小鼠中，约50%的TNF-α和24%的IL-6与迁移体相关分泌（图3h）。此外，WT小鼠的TNF-α和IL-6的总分泌分别比T9 KO小鼠高出1.8倍和1.5倍（图3h）。这些发现共同表明迁移体是单核细胞在体内的主要分泌途径。此外，数据揭示了大量细胞因子是成批在迁移体中释放的。

研究者已经收集了证据，表明血液中总炎症细胞因子的相当一部分包含在循环迁移体中。研究者进一步研究了这些迁移体包装的细胞因子是否可以在迁移体从细胞分离后释放。为此，研究者从表达TNF-α-GFP的L929细胞中分离迁移体，并在含钙缓冲液中培养这些富集的迁移体。延时成像显示TNF-α-GFP阳性分泌囊泡逐渐与迁移体膜融合，表明这种融合可以在迁移体分离后发生。为了确定这种融合是否可以在生理条件下发生，研究者从血清中分离单核细胞来源的CCR2阳性迁移体，然后在血清中培养24小时。培养后，研究者用TNF-α抗体对迁移体进行免疫染色。研究者的观察表明，在直接从血清中分离的迁移体（未培养）中，大多数TNF-α信号是腔内的。然而，在24小时培养后，几乎所有TNF-α信号都出现在迁移体膜上，表明含有TNF-α的分泌囊泡与迁移体膜融合。为了更深入地了解迁移体持续释放细胞因子的生化机制，研究者通过过滤从等量血清中分离迁移体和可溶性细胞因子，并比较有无24小时培养的样本。在未培养的迁移体分数（M）中，TNF-α以加工和未加工形式存在。在24小时培养后，研究者注意到无论其形式如何，TNF-α水平显著降低。同样，迁移体分数中IL-6的量在培养后显著减少。相反，可溶性TNF-α和IL-6（S分数）的水平在培养后增加，表明这些细胞因子从迁移体中释放。当培养反应用BAPTA-AM处理时，TNF-α和IL-6的释放被抑制，支持细胞因子释放是通过SNARE依赖性融合过程促进的观点。研究者发现分离的迁移体可以包含TNF-α和IL-6，这意味着在分离后，迁移体可能作为信号配体的囊泡载体。为了确定迁移体包装的细胞因子是否具有功能，研究者研究了迁移体是否可以传递TNF-α信号。利用TNF-α和caspase 8抑制剂zVAD的组合可以在L929细胞中诱导坏死的知识，研究者发现将分离的单核细胞来源迁移体和zVAD引入L929细胞可以有效地导致细胞死亡。鉴于TNF-α和TACE都存在于迁移体上，研究者接下来检查了迁移体结合的TNF-α是否可以被TACE切割以产生可溶性TNF-α。研究者观察到TNF-α确实可以从迁移体上被切割下来，并且这种切割和迁移体介导的细胞杀伤可以通过添加TACE抑制剂部分抑制。因此，细胞毒性效应似乎是从迁移体释放的裂解的自由TNF-α和迁移体相关TNF-α的综合结果。这些结果表明迁移体可能使细胞因子在血液中持续释放的机制。

迁移体富含粘附分子，如整合素。内皮细胞在炎症期间经历“内皮激活”，这一过程以粘附分子的上调为特征。研究者推测循环迁移体可能选择性地粘附到正在经历局部炎症的血管系统区域。

为研究迁移体包装的细胞因子的潜在生理作用，研究者使用局部炎症检测。用小剂量LPS注射小鼠肝脏，接下来从血液中纯化CCR2阳性迁移体，用抗CCR2抗体染色，然后注入尾静脉。研究者观察到外源性注入的CCR2阳性迁移体迅速在LPS注射部位积累，导致CCR2信号的积累（图4a）。相比之下，局部PBS注射并未导致外源性迁移体积累。

为了确定在血液中循环的内源性单核细胞来源迁移体是否也靶向炎症部位，腹腔注射LPS以提高循环中的单核细胞水平。LPS注射后2小时，研究者注入抗CCR2和抗TNF-α抗体以标记单核细胞来源迁移体。观察到CCR2和TNF-α阳性迁移体迅速在LPS注射部位积累，但在PBS注射部位没有积累，表明循环中的单核细胞来源迁移体可以迅速靶向炎症部位（图4b）。相比之下，在T9 KO小鼠中，LPS注射部位的CCR2和TNF-α信号的积累显著减少，进一步证实了迁移体对于局部炎症部位的细胞因子靶向递送是必需的（图4c）。总之，研究者的数据指向了一种以前未被识别的细胞因子递送机制。这一机制确保了各种细胞因子通过迁移体快速运输到局部炎症部位，并且这些迁移体随后作为细胞因子的持续局部来源。研究者的发现为炎症反应期间细胞因子靶向的复杂机制提供了新的见解（图4d）。

这篇文章揭示了单核细胞在LPS刺激下释放富含炎症细胞因子（如TNF-α和IL-6）的迁移体，这些迁移体在循环中作为细胞因子的主要载体。研究发现，迁移体是单核细胞分泌细胞因子的主要途径，且Tspan9基因敲除小鼠的单核细胞迁移体形成受损，导致血液中总细胞因子水平显著降低。此外，迁移体能够在分离后持续释放细胞因子，并且在局部炎症发生时，循环中的单核细胞衍生迁移体能迅速靶向炎症部位，为细胞因子的局部递送提供了新机制，对理解免疫反应调节具有重要意义。

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Jiao H, Li X, Li Y, et al. Packaged release and targeted delivery of cytokines by migrasomes in circulation. Cell Discov. 2024;10(1):121. Published 2024 Dec 9. doi:10.1038/s41421-024-00749-x