靶向DLL4的CAR-T疗法通过消除肿瘤干细胞和重塑HER2+乳腺癌的免疫微环境使新辅助化疗增敏

曲妥珠（trastuzumab）单抗、帕妥珠（pertuzumab）单抗和紫杉醇（THP）联合新辅助治疗可显著改善人表皮生长因子受体2 (HER2)+乳腺癌（BC）患者的预后。然而，仍有一部分无反应的患者。因此，本研究试图确定THP新辅助治疗耐药的关键调节因子和潜在的致敏靶点。利用Cancer Genome Atlas数据库、Gene Expression Omnibus数据库和膜蛋白数据库，鉴定THP新佐剂耐药的关键调控因子。采用生物信息学分析、多重免疫荧光、流式细胞术、成球实验和染色质免疫沉淀等方法，研究了δ -样4蛋白（DLL4）在体外和体内THP耐药中的生物学功能和机制。此外，建立了靶向DLL4的嵌合抗原受体(CAR)-T细胞对THP治疗增敏。DLL4被确定为HER2+ BC THP新辅助治疗耐药的关键靶点。本研究揭示了DLL4在细胞干性和免疫浸润中的新功能，包括NETs的形成和T细胞的排斥，这些共同促成了HER2+BC中THP新辅助治疗的耐药。此外，作者提供了一种基于CAR的治疗方法来提高THP新辅助治疗的敏感性。该文章于2024年11月发表在《Journal for immunotherapy of cancer》，IF：10.3。

为了描述影响新辅助化疗耐药的因素并预测化疗反应性，作者设计了一个三步综合筛查策略。首先，从癌症基因组图谱（TCGA）数据库中检测HER2+ BC中包含扩增和缺失的基因拷贝数变异，并建立了包含111个扩增基因的候选基因库（库1），作为肿瘤起始的关键生物标志物。接下来，从公共数据库（GSE181574和GSE76360）中获得44例接受新辅助THP治疗的HER2+ BC患者和另外30例接受曲妥珠单抗联合化疗作为新辅助化疗的患者的RNA表达谱。基因富集分析（GSEA）显示，在非病理完全反应（NPCR）组中，免疫相关通路富集，特别是免疫活性的负调控，同时Notch信号通路富集。京都基因与基因组百科全书（KEGG）和基因本体（GO）分析也得到了类似的结果。通过分析PCR组和NPCR组之间不同的表达基因（DEGs），确定了NPCR组中含有上调基因的第二个候选文库（文库2）。此外，考虑到膜蛋白可以作为治疗性抗体开发和其他药物的有价值靶点，作者随后从许多与膜蛋白相关的数据库（TMbase、Steve White、OPM数据库和MemProtMD数据库等）中收集了编码膜蛋白的候选基因作为作者的第三个候选库。

最后，对三个候选基因库进行交叉，获得共同的DEG，包括DLL4、SLC22A12、CD24。在这些DEG中，DLL4被鉴定为耐药患者中差异过表达最多的膜蛋白，DLL4过表达可能导致THP耐药。总之，通过扩增基因、NPCR基因和膜蛋白三个候选文库，作者最终确定DLL4是介导THP新辅助化疗耐药的潜在靶点。

首先，作者评估了DLL4在HER2+BC中的表达模式。如图1A、B所示，与匹配的非肿瘤组织相比，THP耐药肿瘤组织中DLL4的表达水平异常过表达。在作者的中心队列和TCGA数据库中，低DLL4水平的HER2+患者的总生存期（OS）和疾病特异性生存期（DSS）显著延长。此外，在公共数据库中THP新辅助化疗不良反应人群中，DLL4过表达（图1C）。根据DLL4对肿瘤细胞的染色程度和染色强度，将DLL4在HER2+ BC中的表达分为5个水平。同样，HER2+ BC队列的回顾性分析显示，高基线DLL4表达与MRI确定的THP新辅助化疗耐药和肿瘤大小变化（图1D-E）显著相关。此外，只有肿瘤DLL4表达水平在PCR和NPCR患者之间存在差异（图1F），与反应性呈负相关（图1G）。为了进一步阐明DLL4+肿瘤细胞在THP治疗耐药中的因果作用，作者将小鼠4t1 - her2载体和4T1-HER2-DLL4细胞注射到BALB/c小鼠的脂肪垫中，然后用THP或对照物治疗（图1H）。作者的研究结果显示，在对照组中，THP治疗显著减轻了肿瘤负担，而在DLL4过表达（4T1-HER2-DLL4）组中，THP治疗仅具有轻微的抗肿瘤作用（图1I，J）。作者观察到DLL4高的类器官比DLL4低的类器官具有更低的凋亡率和更高的IC50值（图1K，L）。DLL4还能降低THP治疗4T1肿瘤细胞的凋亡率（图1M-O）。SKBR-3载体和SKBR3-OE细胞系的体内和体外实验结果一致。这些发现支持DLL4+肿瘤细胞参与THP新辅助化疗的耐药。

为了进一步阐明DLL4+肿瘤细胞在HER2+BC中诱导THP治疗耐药的机制，作者使用了来自小鼠HER2过表达乳腺肿瘤的单细胞测序数据（GSE166321）（图2A-C）。GSEA在DLL4阳性癌细胞的胚胎干细胞(ES)/干细胞基因特征中显著富集（图2D）。因此，作者试图研究DLL4+肿瘤细胞是否在HER2+ BC中表现出CSC特性，并与化疗耐药相关。作者发现，与DLL4−肿瘤细胞相比，DLL4+肿瘤细胞形成更多的肿瘤球，ALDH1酶活性增加，CD44+CD24−肿瘤细胞比例更高（图2E-J）。此外，3例患者的DLL4+肿瘤细胞中的信使RNA（mRNA）和干细胞相关基因（Sox9、Sox2、Oct4和Nanog）的蛋白水平也升高（图2K-N）。此外，体内有限稀释实验证实，DLL4+肿瘤细胞增加了肿瘤发病率（图2O）。根据DLL4的基线表达，建立SKBR-3-OE、SKBR-3-KD、4T1-HER2-OE和BT474-KD细胞系。在DLL4下调或上调后的BT474、4T1-HER2和SKBR-3细胞系中也观察到一致的结果，强调了DLL4在维持BC中CSC表型中的关键作用。

作者进一步询问DLL4是否以Notch通路依赖的方式调节癌症干细胞。Notch信号通路在DLL4+肿瘤细胞中被激活（图2P-R）。此外，γ-分泌酶抑制剂MK-0752阻断Notch通路后，DLL4+肿瘤细胞的球体形成能力、ALDH1酶活性和CD44+CD24−细胞比例均下降（图2S-U）。MK-0752还逆转了DLL4+肿瘤细胞中干细胞相关基因的表达（图2V），突出了Notch信号在维持DLL4+肿瘤细胞干细胞性中的关键作用。

越来越多的证据表明，CSCs可能重塑肿瘤免疫微环境以增强免疫逃避。考虑到与PCR组相比，NPCR组对免疫活性通路的负调控更为丰富，作者进一步探讨了DLL4是否可以重塑HER2+ BC的免疫景观。因此，作者使用CIBERSORT方法对gene expression Omnibus数据库中的RNA bulk sequence基因表达数据37进行反褶积，估计NPCR组免疫细胞浸润的多样性和相关细胞组分，发现T细胞的比例显著降低（图3A，B）。如图3C、D所示，THP新辅助化疗耐药患者细针穿刺标本中CD3+ T细胞总量减少，其中CD8+ T细胞和CD4+T细胞在化疗耐药患者中均减少（图3E-H），说明T细胞浸润在新辅助化疗耐药患者中受到限制。此外，作者发现CD8+T细胞和CD4+T细胞的比例在高DLL4 +肿瘤细胞患者中都有所下降（图3I，J，L，M）。此外，作者还发现，在高DLL4 +肿瘤细胞患者中，CD8+和CD4+ T细胞位于离肿瘤细胞更远的地方（图3K，N）。与此一致的是，体内实验也证实了CD3+ T细胞、CD8+ T细胞和CD4+ T细胞的比例在4T1-HER2-DLL4肿瘤中都有所下降。

为了进一步评估DLL4是否通过减少t细胞浸润诱导化学耐药，作者进行了体内t细胞缺失实验。如图3O、Q所示，CD3+ t细胞缺失可以减弱DLL4在THP治疗耐药中的作用。更重要的是，在CD3+T细胞中，CD4+T细胞和CD8+T细胞都参与了DLL4诱导的治疗耐药，但CD8+T细胞起主导作用。综上所述，这些数据强调DLL4可以重新连接肿瘤免疫微环境，并与限制t细胞浸润有关，从而增强肿瘤对THP治疗的抵抗力。

为了进一步研究DLL4对免疫微环境的影响并阐明HER2+ BC中t细胞排斥的机制，作者分析了RNA批量测序数据，并观察到在DLL4高表达的肿瘤中髓细胞群，特别是中性粒细胞和巨噬细胞的显著增加（图4A）。然而，在作者的队列患者中，作者没有观察到新辅助化疗耐药患者或DLL4+肿瘤细胞水平高的患者中巨噬细胞（包括M1和M2）或树突状细胞（DC）群体的明显改变。然而，在新辅助THP治疗耐药患者中发现中性粒细胞浸润增加。在高水平DLL4+肿瘤细胞的患者中观察到一致的结果。此外，对细胞内通讯网络的分析显示，DLL4+癌细胞与中性粒细胞之间的相互作用增强（图4C，D），特别是在这种情况下Notch信号的激活（图4E）。此外，作者发现中性粒细胞浸润与CD3+T细胞呈负相关（图4F）。这些发现提示中性粒细胞与THP治疗耐药之间存在潜在关联。

中性粒细胞作为先天免疫吞噬细胞，在免疫调节中起着关键作用，具有吞噬、脱粒和释放nets等功能作者发现，在高DLL4+肿瘤细胞水平的患者中，总中性粒细胞和发生NETosis的中性粒细胞（MPO+中性粒细胞）水平增加（图4G-H），MPO+细胞和DLL4+细胞之间呈正相关（图4I）。然后分离原代小鼠中性粒细胞，与不同条件培养基共培养（图4J）。小鼠中性粒细胞对4T1-HER2-DLL4肿瘤细胞的上清液表现出更强的迁移反应（图4K-L），发生NETosis的中性粒细胞比例增加（图4M-N）。使用人早幼粒细胞白血病细胞系（HL-60）原代BC肿瘤细胞和SKBR-3肿瘤细胞的上清液也获得了类似的结果。以上结果提示，DLL4过表达的肿瘤细胞上清液可诱导中性粒细胞浸润和NETosis的形成。

为了进一步确定DLL4+肿瘤细胞是否通过诱导HER2+ BC中NET的形成来限制T细胞浸润，作者用蛋白精氨酸脱亚胺酶4抑制剂GSK484处理荷瘤小鼠，该抑制剂可以抑制中性粒细胞NETosis，在不影响中性粒细胞数量的情况下显著抑制NET的形成。此外，GSK484挽救了4T1-HER2-DLL4组的t细胞浸润。更重要的是，作者观察到在THP加GSK484治疗后，DLL4过表达组的肿瘤负荷显著降低。综上所述，DLL4+肿瘤细胞通过诱导NET形成限制T细胞浸润，进一步促进HER2+ BC中THP治疗抵抗。

作者进一步研究了DLL4+肿瘤细胞诱导NET形成和浸润的机制。DLL4是一种由685个氨基酸组成的I型跨膜蛋白，其胞外信号域可从膜上脱落形成可溶性DLL4（sDLL4）但sDLL4是否可以直接与中性粒细胞相互作用并诱导NETosis仍然未知。为了解释这一点，用重组小鼠DLL4（rmDLL4）处理原代小鼠中性粒细胞。结果显示，rmDLL4处理后，中性粒细胞的迁移和NETosis水平均增加（图5A-D）。NETosis关键调节蛋白的mRNA和蛋白水平也升高（图5E-6H）。在SKBR-3细胞系中获得了一致的结果。此外，sDLL4中和抗体可以逆转小鼠中性粒细胞的迁移和NETosis的形成（图5I-L），这表明sDLL4从DLL4+肿瘤细胞中脱落直接导致中性粒细胞募集和NET的形成。

sDLL4可以结合Notch受体，激活Notch信号通路，调节下游基因的转录。为了探索Notch信号通路在sDLL4诱导NETs形成过程中的作用，作者使用γ-分泌酶抑制剂MK-0752阻断中性粒细胞中的Notch信号，MK-0752减弱rmDLL4诱导的迁移能力增强和NET形成（图5M-P）。MK-0752处理后，原代小鼠中性粒细胞和HL-60中NETosis关键调节蛋白的mRNA和蛋白水平也降低（图5Q-T），证实了Notch信号对这些酶的调节作用。作者进一步发现，Notch信号通路的重要转录调控因子RBPJ具有基序，可以结合PDIA4、MPO和ELANE基因的启动子区域，rhDLL4进一步增强RBPJ，促进NEToisis相关基因的转录。

作者的研究结果强调了DLL4+肿瘤细胞在THP新辅助化疗耐药中的重要作用，因此作者认为消除该细胞亚群可能会潜在地使HER2+ BC对THP化疗敏感。为了特异性根除DLL4+肿瘤细胞亚群，产生了靶向DLL4的CAR-T细胞（图6A）。基于小鼠DLL4抗体的单链片段变量（scFV）序列，构建了由IRES驱动的小鼠DLL4靶向CAR。共培养24小时后，4T1-HER2-DLL4肿瘤细胞（DLL4高密度）在mDLL4 CAR-T中诱导的IFN-γ和IL-2分泌量远高于4T1-HER2载体肿瘤细胞（图6B，C），这表明DLL4表达是CAR-T效应功能的驱动因素。与NTD相比，DLL4-CAR-T细胞在广泛的效应细胞：肿瘤细胞（E:T）比率（图6D）上对4T1-HER2-DLL4肿瘤细胞显示出强大的裂解功能，证实了作者设计的DLL4靶向CAR-T细胞的可用性。

此外，与单独THP治疗相比，DLL4-CAR-T细胞和THP联合化疗显著增加了DLL4高类器官和THP耐药类器官的凋亡率（图6E-G）。此外，作者还建立了THP耐药小鼠MMTV-Neu肿瘤细胞系（THPR肿瘤细胞）。与此一致的是，THPR肿瘤细胞通过DLL4保持干性并诱导NETosis。作者发现，DLL4靶向CAR-T细胞也表现出对THPR细胞系的有效杀伤能力，逆转了其THP治疗抵抗模式。这些结果表明，DLL4靶向CAR-T细胞可以使THP化疗在耐药的HER2+ BC肿瘤中变得脆弱。

此外，作者还研究了DLL4靶向CAR-T细胞的体内细胞毒功能（图6H）。结果显示，在4T1-HER2-DLL4荷瘤（图6I）或THPR荷瘤受体小鼠中，DLL4 CAR-T细胞的额外治疗显著逆转了THP化疗的耐药性，并伴有免疫微环境的重塑（图6J-L）。结果表明，DLL4靶向CAR-T细胞在体内对thp耐药样品具有有效的细胞毒功能。此外，作者在体内和体外均发现抗DLL4 CAR-T在THP耐药肿瘤细胞中表现出比抗HER2 CAR-T更强的杀瘤活性，这可能是由于HER2在THP耐药肿瘤细胞中的表达较低。这些结果表明，抗DLL4 CAR-T对THP耐药的HER2+ BC具有更精确和特异性的靶向能力。

为了检测DLL4 CAR-T细胞在体内的长期抗肿瘤效果，作者在第7天、第14天、第21天、第28天收集每只小鼠的外周血单个核细胞。如图6M-O所示，抗DLL4 -CAR-T治疗组在第28天血清中EGFP+CAR-T细胞比例和IFN-γ或IL-2水平仍保持较高水平。同样，CAR-T细胞在肿瘤中的比例仍然保持在较高水平（图6P）。抗DLL4 CAR-T疗法的安全性是可以接受的。总的来说，作者的数据表明，通过DLL4 CAR-T细胞根除DLL4+肿瘤细胞可以使HER2+ BC的化疗增敏，具有长期的抗肿瘤作用和安全性。

作者的研究结果首先表明，DLL4通过双重机制参与了HER2+ BC中肿瘤细胞干性增强和淋巴细胞浸润减少的THP耐药的新辅助治疗。可以想象，在HER2+ BC中，DLL4靶向治疗的进一步临床翻译可以降低肿瘤细胞的干细胞性，增强淋巴细胞浸润，并对双重HER2阻断治疗的效果敏感。

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