国自然热点-去SUMO化文章精讲

骨髓基质细胞（BMSCs）对于防止多发性骨髓瘤（MM）细胞因化疗诱导的凋亡至关重要，但其在他形式细胞死亡中的作用和机制尚未得到充分阐明。在这里，我们使用体外BMSC-MM相互作用模型观察到，BMSCs通过提高谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）的水平，保护MM细胞免受不稳定铁池（LIP）和活性氧（ROS）触发的铁死亡。从机制上讲，BMSCs的直接相互作用通过CD40/CD40L信号通路在MM细胞中上调了SUMO特异性蛋白酶3（SENP3）的表达，并且SENP3在赖氨酸75残基处解除了SUMO2的共价连接，从而稳定了GPX4蛋白，通过消耗ROS来消除Vk*MYC小鼠模型中的MM细胞以及在Cd40lfl/fl;Prx1Cre/+小鼠（CD40-CKO）和Sumo2敲除（SUMO2-KO）小鼠中分离出的CD138+B220-细胞的铁死亡。我们还验证了靶向SENP3增强了GPX4抑制剂RSL3的杀伤效果，从而减少了肿瘤负担，延长了小鼠的生存期，并减轻了携带MM肿瘤的小鼠的骨骼破坏。我们的研究解析了BMSCs防止MM细胞自发铁死亡的机制，并明确了非凋亡策略在管理难治性或复发性MM患者中的治疗潜力。本文于2024年12月发表于“Cancer Lett”（IF=9.1）上。

技术路线：

结果：

1）BMSCs上调GPX4以消除MM细胞中的铁死亡

我们最近的研究发现，与BMSCs的直接相互作用提高了MM细胞中的铁水平，而不稳定铁池（LIP），一种含有氧化还原活性铁复合物的池，可以通过直接产生ROS来触发铁死亡，但我们没有在MM细胞中检测到铁死亡。有趣的是，我们发现与BMSCs共培养提高了MM细胞中LIP的积累（图1a），然而ROS水平相对较低（图1b和c）。因此，我们使用与单克隆抗人CD138抗体结合的微珠（图1d）对BMSCs-MM相互作用系统中的MM细胞进行了蛋白质组学分析，并鉴定了387个差异表达蛋白（DEP），包括234个上调和153个下调的蛋白（图1e）。在所有上调蛋白中，GPX4和FTH1被列为变化最大的蛋白，以及转铁蛋白和转铁蛋白受体（TFRC）（图1f）。有趣的是，KEGG分析显示，这些DEP在调节铁死亡、矿物质吸收、不饱和脂肪酸（UFA）和脂肪酸延长方面富集（图1g）。我们验证了GPX4和FTH1的蛋白水平在BMSC相互作用的MM细胞中都有显著升高（图1h）。值得注意的是，对临床队列GSE4500和GSE9782的分析表明，GPX4的表达从骨髓浆细胞（BMPC）阶段逐渐增加到单克隆丙种球蛋白病不确定意义（MGUS）和冒烟型多发性骨髓瘤（SMM）的状态（图1i）。此外，较高的GPX4水平预示着对治疗的反应较差（图1j），以及GSE4581和GSE9782队列中MM患者的临床结果较差（图1k和l）。这些结果表明，BMSCs上调GPX4水平以促进MM细胞的存活。

2）SENP3与GPX4相互作用稳定GPX4

迄今为止的结果表明，升高的GPX4是保护共培养MM细胞免受铁死亡的关键因素，然后我们试图解码GPX4上调的机制。我们进行了免疫沉淀和质谱分析，并确定SUMO特异性肽酶3（SENP3）在共培养的MM.1S细胞中flag标记的GPX4蛋白的相互作用组中富集（图2a），并且在MM细胞的细胞质和细胞核中检测到GPX4和SENP3的共定位（图2b）。此外，通过共免疫沉淀（Co-IP）实验验证了内源性和外源性相互作用（图2c和d）。蛋白质-蛋白质对接实验预测了SENP3和GPX4之间的直接相互作用（图2e），其体外直接相互作用通过GST下拉实验得到验证（图2f）。同时，当SENP3在MM细胞中过表达时，GPX4蛋白显著上调（图2g），然而敲减SENP3明显抑制了GPX4水平（图2h）。为了评估SENP3对体内GPX4蛋白的影响，我们通过将Gpx4-floxp小鼠与Cd19-Cre删除小鼠杂交，构建了B细胞条件性敲除SENP3敲除（CKO）小鼠。正如预期的那样，与Senp3fl/fl;WT对照组相比，Senp3的耗竭明显抑制了来自Senp3fl/fl; Cd19-cre小鼠的B细胞中GPX4蛋白水平（图2i）。以上所有结果都表明SENP3通过直接相互作用稳定GPX4。

3）GPX4的降解依赖于SUMO2

由于SENP3调节核糖体成熟，我们进一步评估了GPX4蛋白如何在翻译后进行修饰。在SENP3过表达（SENP3-OE）的MM细胞中，GPX4增加（图3a），而在SENP3敲减（SENP3-KD）的MM细胞中GPX4减少（图3b），而SENP3未能改变GPX4的mRNA水平（图3c）。考虑到SENP3是一种SUMO特异性酶，我们接下来分析了哪种SUMO分子，包括SUMO1、SUMO2和SUMO3，在GPX4的SUMO化中占主导地位。有趣的是，尽管GPX4可以被所有SUMOs修饰，但与另外两种相比，SUMO2在修饰GPX4方面更为主导（图3d）。SUMO2的过表达，而不是SUMO1或SUMO3，以剂量依赖性的方式抑制了GPX4水平（图3e，f，3g）。重要的是，SUMO2对GXP4的影响可以通过蛋白酶体抑制剂MG132消除（图3h）。为了评估SUMO2对体内GPX4蛋白的影响，我们构建了Sumo2敲除小鼠（Sumo2-KO）。正如预期的那样，在Sumo2-/- B淋巴细胞中，GPX4水平显著升高（图3i和j）。这些结果表明SUMO2介导了GPX4的降解。

4）SENP3在K75处使GPX4的SUMO2脱偶联

接下来，我们试图探索GPX4蛋白上的SUMO化修饰位点。正如预期的那样，在SENP3-KD MM细胞中，由SUMO2修饰的内源性GPX4的SUMO化水平显著增加（图4a），而SENP3的过表达减轻了由SUMO2修饰的内源性GPX4的SUMO化水平（图4b），并通过消除SUMO2的共价结合来挽救GPX4的抑制（图4c和d）。在预测GPX4蛋白的氨基酸序列时，我们发现K11、K75、K107、K117和K126残基是潜在的SUMO化位点（图4e）。所有这些赖氨酸残基似乎都可以被SUMO2共价结合（图4f），但只有K75共价结合的SUMO2介导的SUMO化对GPX4蛋白产生了最大的修饰效果（图4g），证据表明当GXP4蛋白上的第75位赖氨酸突变为精氨酸时，SUMO2的过表达无法降解底物（图4h）。以上所有结果表明，SENP3通过SUMO化修饰从GPX4蛋白的K75位点上解除了SUMO2的共价结合，从而稳定了GPX4。

5）SENP3与MM的临床进展相关

在多发性骨髓瘤（MM）的进展过程中，我们分析了独立队列GSE9782和GSE2113，并观察到SENP3的表达从骨髓浆细胞（BMPC）阶段逐渐增加到单克隆丙种球蛋白病不确定意义（MGUS）和冒烟型多发性骨髓瘤（SMM）的状态（图5a），在活动性多发性骨髓瘤中甚至更高（图5b）。我们MM队列的临床样本进一步证实了SENP3表达与骨病变数量之间的正相关关系（图5c）。此外，与初诊样本相比，接受基于硼替佐米方案治疗的RRMM患者中分离的CD138+浆细胞中SENP3和GPX4的蛋白水平都有所增加（图5d），且这两种蛋白之间存在显著的正相关（图5e）。值得注意的是，通过免疫组化（IHC）也发现了SENP3和GPX4的上调（图5f，g，5h）。与对照相比，SENP3表达缺陷的MM细胞对硼替佐米治疗更为敏感（图5i）。同时，GSE4581和GSE9782队列中MM患者SENP3较高的表达水平与较差的总生存期相关（图5j和k），以及GEO、EGA和TCGA数据库的综合Kaplan-Meier Plotter分析也显示这一点（图5l）。总的来说，这些发现表明SENP3表达与临床上MM的疾病进展密切相关。

6）CD40/CD40L 桥接BMSCs和MM之间的相互作用以调控SENP3表达

我们进一步建立了体外和体内模型来阐明BMSCs如何调节SENP3表达。在两个BMSC-MM相互作用的共培养系统（图6a）中，仅在细胞-细胞接触条件下，我们观察到GPX4和SENP3的蛋白水平显著增加（图6b），GPX4的SUMO化减少了（图6c），而GPX4的mRNA水平没有检测到变化（图6d）。使用VkMYC小鼠MM模型（图6e），我们观察到与来自外周血或脾脏的细胞相比，来自骨髓的CD138+B220-细胞中GPX4和SENP3的水平明显更高（图6f），这表明直接相互作用方式起着决定性作用。接下来，我们探索了哪种细胞粘附分子介导BMSCs和MM细胞之间的相互作用。根据之前的报告，我们分别删除了MM细胞上的三个主要分子，包括VLA-4、MUC1和CD40，并发现只有CD40的耗竭，而不是VLA-4或MUC1，在细胞-细胞接触模型中未能上调GPX4或SENP3水平（图6g），并且BMSCs中CD40-KD未能减少MM细胞中由SUMO2介导的GPX4蛋白的SUMO化（图6h）。此外，在细胞-细胞接触系统中使用抗CD40中和抗体抵消了BMSC诱导的GPX4和SENP3水平的增加（图6i），加剧了由SUMO2介导的GPX4的SUMO化（图6j）。同样，当BMSCs中CD40L耗竭时，共培养的MM细胞中GPX4和SENP3水平几乎没有增加（图6k），GPX4的SUMO化明显加剧（图6l）。与Cd40lfl/fl;WT小鼠相比，来自骨髓的CD138+B220-细胞中GPX4和SENP3受到显著抑制（图6m和n）。这些结果表明，CD40-CD40L途径是BMSCs和MM细胞之间上调MM细胞中SENP3的关键桥梁，从而稳定GPX4以消耗ROS。

7）SENP3促进MM细胞对铁死亡的抵抗

由于GPX4是铁死亡的关键调节器，我们接下来讨论SENP3在触发铁死亡中的作用。如预期的那样，当SENP3被耗竭时，MM细胞中ROS明显积累（图7a和b），并且SENP3的耗竭导致对GPX4抑制剂的敏感性增加（图7c），因为与对照细胞相比，RSL3显著诱导了更多的MM细胞死亡（图7d）。然而，当铁死亡被铁螯合剂DFO或铁死亡抑制剂Ferrostatin-1（Fer-1）阻断时，SENP3对RSL3诱导的铁死亡的防护作用被无效化（图7e）。为了定义SENP3在体内调节铁死亡的作用，我们使用SENP3-KD和对照MM.1S细胞构建了NSG小鼠基于异种移植和骨髓内MM生长的小鼠模型（图7f）。在异种移植模型中，当SENP3被抑制时，RSL3表现出显著的抗MM效果（图7g），并且SENP3-KD组的小鼠总体生存率显著延长（图7h）；在骨髓内小鼠模型中，用RSL3治疗的SNEP3-KD细胞携带的小鼠骨髓中的肿瘤负担显著减少（图7i），并且骨病变明显缓解（图7j），这也通过骨小梁的三维重建测量得到了证实（图7k），以及包括 BV/TV百分比更高、皮质厚度更大、小梁数量更多以及远端和骨干小梁分离尺寸更小的定量分析（图7l）。总的来说，这些数据强烈表明SENP3促进了MM细胞对铁死亡的抵抗。

结论：

骨髓基质细胞通过CD40/CD40L信号通路在多发性骨髓瘤细胞中上调SENP3，并且SENP3将SUMO2从GPX4的K75位点解离，以稳定GPX4，从而防止骨髓间充质干细胞与MM细胞相互作用导致铁代谢引发铁死亡。我们的研究揭示了SENP3在调节铁死亡中的作用，并为临床治疗复发性难治性多发性骨髓瘤提供了新的治疗策略。

实验方法：

KEGG通路分析、临床队列分析、Kaplan-Meier生存分析、蛋白质组学分析、Real-time PCR、Western Blotting、免疫沉淀和质谱分析、GST-pulldown实验、蛋白质-蛋白质对接实验、细胞培养与共培养、流式细胞术、CCK-8实验、免疫共沉淀（Co-IP）实验、基因敲除与过表达、铁死亡诱导实验、异种移植模型、骨髓内模型、基因敲除小鼠模型、通过免疫组化

参考文献：

Jiang H, Li Q, Yang X, Jia L, Cheng H, Wang J, Wang S, Li X, Xie Y, Wang J, Wang Y, Hu M, Guo J, Peng Z, Wang M, Li T, Zhao H, Wang L, Liu Z. Bone marrow stromal cells protect myeloma cells from ferroptosis through GPX4 deSUMOylation. Cancer Lett. 2024 Dec 7;611:217388. doi: 10.1016/j.canlet.2024.217388.