CircMVP：结直肠癌免疫治疗的新靶点

当前结直肠癌（CRC）免疫治疗效果受限于抗肿瘤免疫抑制，circRNA 与肿瘤免疫的关联备受关注。研究人员经生物信息分析、qRT-PCR、原位杂交等实验发现，CRC 患者中 circMVP 表达上调，且与预后不良相关。功能实验证实，circMVP 可促进 CRC 细胞增殖、侵袭和体内肿瘤发生。机制上，circMVP 与 METTL3 相互作用，稳定其在细胞核中的表达，增强 CTNNB1 的 m6A 修饰，提升 β - 连环蛋白表达，进而激活B7-H3 表达，抑制抗肿瘤免疫反应。重要的是，抑制 circMVP 表达能显著改善抗 B7-H3 免疫治疗效果。该研究表明 circMVP 或可作为 CRC 免疫逃逸的预测指标和潜在治疗靶点，为 CRC 免疫治疗开辟新思路。这篇文章于2025年1月发表于《International Journal of Biological Sciences》期刊上，IF:8.2。

在结直肠癌样本中共鉴定出228个独特的circRNA候选分子。其中，与作为对照的配对正常组织相比，有19个circRNA在结直肠癌组织中表达上调，18个表达下调（log2|倍数变化|≥1且P<0.05；图1A）。散点图展示了结直肠癌组织与配对的相邻正常组织之间circRNA表达的差异（图1A）。circMVP（hsa_circ_0000688，别名_000014）由MVP基因第8外显子反向剪接形成，剪接后序列长度为256nt（图1B），在结直肠癌组织中呈稳定上调趋势。桑格测序也验证了其头对尾融合位点的排列（图1C）。Northern印迹分析表明circMVP在结直肠癌细胞中表达（图1D）。

使用RKO（结直肠癌细胞）和293T细胞来研究circMVP的存在情况。通过设计特异性的发散引物和收敛引物进行PCR和琼脂糖凝胶电泳分析，结果显示存在circMVP的反向剪接形式或经典形式，而非线性MVP（图1E）。circMVP的环状结构通过对RNase R消化的抗性得到证实（图1F）。因此，对结直肠癌细胞系DLD1、HCT8、HCT116和RKO中的circMVP表达进行了评估。在这些细胞系中，DLD1和RKO细胞分别表现出最高和最低水平的circMVP表达（图1G）。此外，MVP的表达与circMVP的趋势一致，且这些表达特征与circRNA的生成生物学过程相符（图1G、图1I）。

RNA荧光原位杂交（FISH）检测显示，circMVP主要定位于细胞核中，但在细胞质中也有发现（图1H）。细胞核和细胞质分离实验证实，circMVP主要在细胞核中表达，部分在细胞质中表达（图1I）。在结直肠癌样本中，通过对切除组织切片进行原位杂交（ISH）分析来评估circMVP的表达。结果显示，与正常上皮组织相比，结直肠癌组织中circMVP的表达升高（图1J）。通过单细胞RNA测序（scRNA-seq）评估了结直肠癌免疫微环境的细胞组成。通过PCA对所有细胞进行客观聚类来阐明细胞组成，并使用UMAP进行可视化展示，包括检测CD4+ T细胞、CD8+ T细胞、巨噬细胞、内皮细胞、软骨细胞、平滑肌细胞、单核细胞、上皮细胞、树突状细胞、自然杀伤（NK）细胞、B细胞和成纤维细胞的细胞类型（图1K）。MVP和circMVP主要在上皮细胞（结直肠癌细胞）簇中表达（图1L）。因此，作者研究了circMVP在结直肠癌细胞中的具体表达情况。

测量了结直肠癌细胞系中circMVP的内源性表达，选择了circMVP表达相对较高的DLD1细胞和表达相对较低的HCT8细胞，并根据转染效率进行后续的功能实验。CCK-8和集落形成实验表明，敲低circMVP显著抑制了结直肠癌细胞的增殖和集落形成，而circMVP过表达则促进了这些过程（图2A）。通过Transwell实验进一步研究了circMVP对结直肠癌转移的影响，结果显示敲低circMVP抑制了DLD1和HCT8细胞的迁移和侵袭。相反，circMVP过表达则显著促进了这些过程（图2C和2D）。此外，circMVP沉默抑制了小鼠体内结直肠癌的致瘤性，而circMVP过表达则促进了其致瘤性（图2E和2F）。

通过对人类基因组和小鼠基因组的比较，发现circMVP在多种小鼠来源的细胞中表达，包括结直肠癌细胞，这进一步证明了circMVP在物种间表达的保守性和稳定性（图2G）。通过在C57BL/6小鼠皮下接种MC38细胞建立MC38肿瘤模型。circMVP促进了MC38细胞在体外的增殖、集落形成、迁移和侵袭。相反，敲低circMVP则阻碍了上述过程（图2F - 2H）。确实，抑制circMVP可抑制结直肠癌的致瘤潜能，而其过表达则在C57BL/6小鼠中促进了致瘤性（图2H和图2I）。此外，分析结直肠癌组织样本的空间转录组数据集发现，上皮细胞群落中MVP的转录水平显著更高（图2J、图2K）。综上所述，这些结果表明circMVP具有促进结直肠癌进展的功能。

在体外对circMVP转录本进行生物素标记，以探索其下游分子。根据之前的结果，circMVP主要在结直肠癌细胞的细胞核中表达。因此，使用核蛋白标记链霉亲和素磁珠进行RNA下拉检测（图3A）。通过考马斯亮蓝染色鉴定与circMVP结合的蛋白质。对特异性条带进行蛋白质质谱分析和western blot分析，结果显示circMVP直接与METTL3蛋白结合（图3B、3C）。通过RNA免疫沉淀（RIP）检测进一步证实了circMVP与METTL3的结合，该检测显示了METTL3与circMVP的RIP结果（图3D）。RNA电泳迁移率变动分析（EMSA）证实了circMVP的核酸与METTL3特异性结合。在DLD1细胞中进行的IF和FISH检测表明，circMVP和METTL3主要在细胞核中共定位（图3E）。此外，作者观察到抑制蛋白酶体活性可防止si-circMVP诱导的DLD1细胞内源性METTL3下调，这表明circMVP抑制了METTL3通过泛素化途径的降解（图3F）。

使用蛋白质合成抑制剂环己酰亚胺（CHX）来评估circMVP对METTL3降解过程的影响。在DLD1细胞中敲低circMVP延长了METTL3的降解时间（图3G）。METTL3作为MTase复合物中的关键催化剂，参与m6A修饰的添加过程。因此，评估了METTL3对circMVP表达的影响。RNA稳定性实验表明，circMVP与METTL3结合后稳定性增加。分别转染METTL3质粒和siMETTL3以实现circMVP的过表达和敲低，这表明了circMVP对METTL3的调节作用（图3H）。这些结果表明，circMVP与METTL3结合并稳定其表达，从而发挥促进结直肠癌进展的下游作用。

METTL3作为MTase复合物中的催化核心，负责m6A修饰的整合过程。对circMVP介导的METTL3调节的生物学功能评估显示，通过斑点印迹检测发现circMVP上调了RNA的m6A表达（图4A）。当敲低circMVP或METTL3时，METTL3和m6A的表达下降（图4B）。相反，上调circMVP或METTL3后，METTL3和m6A的表达增加（图4B）。接下来，对在HCT8细胞中稳定过表达circMVP的构建体进行转录组测序。GO分析表明，circMVP激活了包括免疫效应过程、细胞间粘附和上皮细胞增殖等生物学过程（图4C）。KEGG分析表明，circMVP促进了Wnt信号通路的激活、癌症中的转录失调、粘着斑以及细胞粘附分子等途径（图4D）。GSEA分析表明，circMVP促进了Wnt/β - 连环蛋白信号通路的激活。此外，评估了由Wnt/β - 连环蛋白信号通路激活所调节的基因转录水平。circMVP过表达后，由β - 连环蛋白调节的下游基因簇显著上调（图4E）。对细胞中circMVP、METTL3和β - 连环蛋白的表达和定位进行IF分析，结果表明circMVP过表达稳定了METTL3，并上调了β - 连环蛋白的表达和核异位。此外，这表明circMVP/METTL3可能通过β - 连环蛋白信号通路调节下游信号通路和转录激活（图4F）。

m6A修饰参与mRNA代谢的多种分子过程，包括可变剪接、精确翻译和mRNA稳定性的精细调节。本研究旨在通过使用基于序列的RNA腺苷甲基化预测器，分析CTNNB1的RNA序列中m6A修饰位点的分布情况，以探究METTL3介导的m6A修饰的影响。人类和小鼠的CTNNB1 mRNA均具有较高的m6A修饰置信区间。作者进行了m6A甲基化免疫沉淀RNA测序（MeRIP - seq），IGV分析显示METTL3基因敲除（KO）后CTNNB1转录本上的m6A峰减少。此外，基序富集分析揭示了上述m6A峰中存在一个共同的序列基序“GGACU”（图4G）；因此，研究了METTL3的m6A修饰对CTNNB1转录本的影响。在分子水平上，m6A修饰在多种mRNA代谢的调节中发挥作用。为了阐明METTL3介导的m6A修饰对CTNNB1 mRNA代谢的影响，使用PCR - 琼脂糖凝胶电泳对CTNNB1转录本进行定性评估，并使用qRT - PCR对METTL3与CTNNB1 mRNA的结合进行定量分析（图4H）。此外，在小鼠肿瘤细胞系中稳定表达Ctnnb1（小鼠β - 连环蛋白的基因符号），并随后将MC38细胞用作本研究的体内模型。这些结果表明，circMVP/METTL3催化β - 连环蛋白信号通路，并调节其下游基因的转录激活。

YTHDF1是一种关键的m6A读取蛋白，它通过与起始因子和核糖体相互作用，促进m6A的沉积和mRNA的翻译效率。研究了YTHDF1在METTL3对CTNNB1 mRNA的m6A “读取” 效应中的作用。RIP - qPCR和链霉亲和素RNA下拉实验表明，YTHDF1在内源和外源均介导了β - 连环蛋白的增加，且DLD1细胞中CTNNB1的转录没有显著变化（图4I）。qRT - PCR结果表明circMVP/METTL3不影响CTNNB1的转录。随后，使用核糖体分析技术从对照组（NC）和circMVP组中分离出各种RNA组分。结果显示，NC细胞中翻译活跃的多聚核糖体（>80S）中CTNNB1 mRNA的表达显著低于circMVP细胞，而在单体核糖体（<40S、40S、60S和80S）中的表达没有显著差异（图4J）。值得注意的是，在DLD1细胞中过表达METTL3以及在HCT8细胞中下调METTL3后，观察到m6A和β - 连环蛋白蛋白表达的恢复（图4K）。

通过慢病毒将circMVP转染到MC38小鼠结直肠癌细胞中，然后将这些细胞注射到同基因的C57BL6小鼠体内，以研究circMVP在调节抗肿瘤免疫中的作用。与NC组相比，circMVP组中通过ISH和IHC技术检测到circMVP、METTL3、YTHDF1和β - 连环蛋白的表达增强（图5A）。此外，观察到β - 连环蛋白核定位的细胞百分比增加（图5A）。通过分离和收集肿瘤的单细胞悬液并进行scRNA - seq，探索了circMVP对结直肠癌和肿瘤微环境（TME）的影响（NC组：18294个细胞；circMVP组：15040个细胞）。与NC组相比，circMVP组肿瘤中的T细胞和NK细胞显著增加（图5B）。对上皮细胞、CD4+ T细胞、CD8+ T细胞、巨噬细胞、调节性T细胞（Treg）、内皮细胞、中性粒细胞和NK细胞亚群进行了进一步聚类分析，发现与对照组相比，circMVP过表达组中这些细胞均增加（图5B）。作者假设circMVP通过诱导细胞中的负性刺激分子来抑制抗肿瘤免疫。检查了上皮细胞的功能标记物Grb2和Krt14，这些基因主要在上皮细胞簇中富集。通过分析结直肠组织中的TME细胞，研究了circMVP对结直肠癌发生过程中TME的影响。聚类分析显示，与NC组相比，circMVP组中CD45+免疫细胞、CD4+ T细胞、CD8+ T细胞、巨噬细胞、中性粒细胞、NK细胞和树突状细胞（DCs）显著扩增，而成纤维细胞收缩（图5C和图5D）。CD8+ T细胞是主要的抗肿瘤免疫效应细胞，在肿瘤中具有重要作用，并以复杂的方式参与抗肿瘤免疫领域。本研究探索了circMVP对免疫细胞群体的影响，亚群分析显示，与NC组相比，circMVP组中活化的CD8+ T细胞比例下降，而初始CD8+ T细胞比例增加（图5E）。作者还评估了circMVP对NK细胞的影响。根据基因标记物鉴定出成熟、未成熟和其他NK细胞亚型。在circMVP组中观察到未成熟NK细胞比例增加，成熟NK细胞比例下降。在circMVP组中也发现了其他类型的NK细胞，但数量太少无法准确鉴定（图5F）。通过鉴定两个亚群（CD86+巨噬细胞和其他未鉴定的巨噬细胞）来评估circMVP对巨噬细胞的影响（图5G）。此外，在circMVP的作用下，Treg细胞簇进一步分为自然Treg细胞；然而，由于数量减少，无法将其他群落确定为明确的Tregs亚群（图5H）。

上述结果表明，circMVP可能通过影响T细胞干扰结直肠癌的适应性免疫。分析肿瘤（上皮）细胞中免疫检查点标记物的表达，circMVP组中共刺激分子转录水平的改变支持了这一假设。通过对免疫细胞进行流式细胞术分析，证实了circMVP对肿瘤中CD8+ T细胞比例的影响。circMVP过表达组中的CD8+ T细胞显著低于NC组（图5I）。对NC和circMVP标记的CD8+ T细胞进行分析，circMVP组和NC组CD8+ T细胞中的差异表达基因表明，circMVP抑制了CD8+ T免疫反应的激活（图5J）。因此，体内数据的结果支持了circMVP在结直肠癌中的免疫抑制功能。

circMVP 通过增强 METTL3 来调节 β- 连环蛋白的抗肿瘤免疫功能。circMVP的具体调节机制有待进一步评估。先前的研究表明，肿瘤细胞中的 β- 连环蛋白作为共转录因子参与基因调控，包括调节免疫检查点基因的表达。转录组分析显示，CD276（编码 B7-H3）的转录显著上调（图 6A）。核质分离结果显示，在 DLD1 细胞中敲低 circMVP 后，METTL3、β- 连环蛋白和 B7H3 蛋白的表达均下降。circMVP过表达后，METTL3 表达增加，β- 连环蛋白的核信号增强，B7-H3 表达上调（图 6B）。在敲低 circMVP 的 DLD1 细胞中，过表达 METTL3 显著逆转了 β- 连环蛋白和 B7-H3 蛋白的表达变化；而在 HCT8 细胞中，过表达 circMVP 并下调 METTL3 后，B7-H3 的表达也发生了逆转（图 6C）。

接下来，研究 circMVP通过 METTL3/β- 连环蛋白对 B7-H3 的调节作用。ChIP-seq 数据分析显示，β- 连环蛋白作用于 CD276 的染色质区域，并对 IGV 和 MEME 进行基序分析（图 6D）。ChIP PCR - 琼脂糖凝胶电泳和 ChIP qPCR 分析均表明，β- 连环蛋白作用于 CD276 的启动子区域，进而调节 CD276 转录的增加（图 6E 和 6F）。IF 检测显示，敲低circMVP 的 DLD1 细胞中，METTL3 和 β- 连环蛋白的核异位现象减少（图 6G）。敲低 circMVP 可能抑制 β- 连环蛋白作为转录因子的功能，qPCR 结果显示 circMVP 和 METTL3 上调了 CD276 的表达（图 6H）。在蛋白质表达水平上，在稳定过表达 circMVP 的 DLD1 细胞中过表达 METTL3，在稳定过表达 circMVP 的 HCT8 细胞中敲低 METTL3，然后进行核质分离检测，结果表明 circMVP 促进了 β- 连环蛋白的核定位以及 B7-H3 蛋白的增加。敲除 METTL3 则抑制了这一现象（图 6I）。裸鼠肿瘤的 IHC 检测显示，敲低 circMVP 降低了 B7-H3 蛋白的表达，B7-H3 主要在结直肠癌细胞的细胞质和细胞膜中表达，而 circMVP 的表达上调（图 6J）。为探究 METTL3 是否直接作用于 CD276 mRNA 从而影响 B7-H3 蛋白的表达，作者分析了 METTL3 甲基化的 RIPseq 数据集，发现 CD276 中不存在 METTL3 作用的显著峰值。上述结果表明，circMVP 可能通过促进 β- 连环蛋白结合 METTL3 参与转录调控，进而调节 B7-H3 的表达。

circMVP 促进肿瘤生成，并对 T 细胞效应具有抑制作用（图5J）。重要的是，这可能暗示结直肠癌对免疫检查点阻断（ICB）治疗的敏感性受到影响。因此，作者提出假设，针对 circMVP 生成或功能的干预措施可能会增强 ICB 的治疗效果，特别是对于circMVP 阳性且对 ICB 耐药的肿瘤。为验证这一假设，作者用抗 B7-H3 抗体 Omburtamab，或 circMVP 阴性对照（NC）与敲低（shRNA）的组合，处理对 ICB 耐药的 MC38 肿瘤（图 7A）。与作者之前的发现一致，敲低 circMVP 抑制了肿瘤生长（图 7B 和 7C）。此外，抗 B7-H3 组的肿瘤生长明显低于抗 Ig 组。值得注意的是，抗B7-H3 与 circMVP 敲低联合处理的小鼠表现出显著的肿瘤抑制作用（图 7B 和 7C）。尽管单一疗法的疗效在一定程度上令人满意，但 circMVP 沉默与 ICB 联合使用可显著降低肿瘤负担，而 circMVP + 抗 B7-H3 的联合使用显著提高了总体生存率（图 7D）。对肿瘤中 circMVP敲低的 ISH 和 IHC 检测还发现，它降低了 β- 连环蛋白的表达和核异位，同时下调了 B7-H3 的表达（图 7E）。这些发现提供了关键证据，表明 circMVP 可能抑制 T 细胞的抗肿瘤作用以及B7-H3 的 ICB 协同效应。

通过 ISH 评估 circMVP 的表达，并用 IHC 检测结直肠癌组织中 β- 连环蛋白和 B7-H3 的蛋白表达，以此探究 circMVP 与其下游靶点之间的相关性（图 8A）。研究结果显示，在 circMVP 高表达组中，58.02%（94/162）的结直肠癌组织样本表现出 β- 连环蛋白和 B7-H3 表达水平的升高。这一比例明显高于 circMVP 低表达组（图 8B）。单因素和多因素 Cox 比例风险回归分析确定 circMVP、METTL3 和 B7-H3 为结直肠癌的重要预后因素（图 8C 和 8D）。生存分析表明，circMVP 表达与不良生存相关（P=0.0009，图 8E），在 TCGA 结直肠癌患者中，METTL3 高表达（P=0.0054）和 B7-H3 高表达（P=0.0184）也预示着不良预后。此外，结直肠癌样本中 METTL3 和 B7-H3 蛋白的表达均与 circMVP 表达呈正相关（图 8F）。

使用 TCGA（COAD 和 READ）外部结直肠癌队列来验证B7-H3 作为结直肠癌潜在诊断和治疗靶点的作用。TCGA-COAD 分析显示，50.00%（135/270）的结直肠癌患者 B7-H3（CD276）高表达，且预后不良（P=0.046，图 8G）。TCGA-READ 分析显示，11.96%（11/92）的结直肠癌患者 B7-H3（CD276）高表达，且预后不良（P=0.020，图 8G）。总体而言，作者的结果证明，METTL3 通过 circMVP 介导的 CTNNB1 mRNA 的 m6A 修饰促进激活，CTNNB1 翻译的蛋白 β- 连环蛋白在结直肠癌中上调，这抑制了肿瘤微环境中依赖 B7-H3 的免疫抑制。

这项研究证明了circMVP 在结直肠癌中的一种新的调控功能，该功能促进癌细胞生长和免疫抑制。circMVP 与 METTL3 结合，调节 CTNNB1 mRNA 的 m6A 甲基化，上调β-连环蛋白蛋白，并激活 B7-H3 表达。抑制 circMVP 表达干扰了 CRC 中 B7-H3 依赖的抗癌免疫。鉴定 circMVP/METTL3/β-连环素/B7-H3 信号轴为免疫抑制和肿瘤进展的分子机制提供了新的见解，为 CRC 确定了新的免疫治疗靶点。

转录组测序、单细胞 RNA 测序（scRNA - seq）、MeRIP 测序分析、空间转录组测序分析、ISH、FISH、Western blot 、Northern blot、RNA pull-down、RIP、EMSA、PCR、IHC和IF染色、m6A dot blot、ChIP、细胞培养、集落形成、CCK-8、transwell、流式细胞术、小鼠肿瘤模型实验

Wang F, Wang Q, Wu Y, Huang Z, Zhong X, Wang H, Yang C, Qin Y, Qi X, Ge X, Mao Y. CircMVP promotes METTL3 activation mediated CTNNB1 m6A modification in the inhibition of colorectal cancer in B7-H3 dependence antitumor immunity. Int J Biol Sci. 2025 Jan 1;21(1):306-327. doi: 10.7150/ijbs.105324. PMID: 39744434; PMCID: PMC11667818.