乙酰转移酶NAT10通过DDX5/HMGB1轴抑制T细胞免疫，促进鼻咽癌进展

鼻咽癌是一种典型的肿瘤性肿瘤，其特征是多种免疫细胞浸润到肿瘤内部和肿瘤周围，主要是淋巴细胞（T细胞和B细胞）、树突状细胞、单核巨噬细胞、粒细胞和肥大细胞。T细胞和B细胞约占浸润细胞的90%虽然放疗是鼻咽癌的主要治疗方式，但其在晚期或转移性肿瘤患者中的疗效有限免疫疗法已成为包括鼻咽癌在内的各种癌症的一种有前景的治疗方法，因为它具有靶向独特肿瘤微环境的潜力。然而，由于鼻咽癌免疫抑制微环境的复杂性，这种方法存在局限性。因此，进一步研究鼻咽癌患者肿瘤微环境中免疫抑制的机制是必要的。该文章于2025年2月发表在《Journal for immunotherapy of cancer》，IF：10.3。

为了研究ac4C修饰对鼻咽癌免疫微环境的影响，作者首先使用免疫组织化学（IHC）方法评估了150个鼻咽癌组织微阵列中NAT10的表达。染色强度和阳性染色率均分为4个等级（1 ~ 4分），其乘积形成总分。使用X-tile软件对最终染色强度进行量化，低表达为1-8，高表达为9-16。IHC评分与鼻咽癌临床结局的相关性分析显示，与临床I期和II期鼻咽癌患者相比，临床III期和IV期鼻咽癌患者的NAT10表达增高。这些发现表明NAT10表达失调与终末期鼻咽癌之间存在潜在关联（图1A，B）。此外，NAT10上调与鼻咽癌复发和转移有显著相关性（图1C，D）。

生存率分析显示，NAT10高表达患者的临床预后较低表达患者差（图1E）。这些发现被来自基因表达综合数据库和癌症基因组图谱（TGCA）数据库的队列证实。此外，作者利用人类蛋白图谱数据库的数据检测了NAT10在不同人类癌症中的表达，发现NAT10在头颈癌中表达较高，并将其列为前五大肿瘤之一。作者也证实了NAT10在鼻咽癌细胞中的过表达。

随后对NPC和正常组织中ac4C修饰水平的评估显示，与正常组织相比，NPC组织中ac4C表达显著增加（图1F）。这些发现表明，NAT10介导的ac4C修饰是一种有价值的生存生物标志物，与鼻咽癌进展有关。为了探索NAT10和ac4C修饰在NPC中的致癌作用，作者用GFP标签或CRISPR-Cas9转染NAT10慢病毒，在CNE2细胞中过表达或敲除NAT10并验证其效率。Cas9细胞中ac4C修饰水平降低，如点状染色所示（图1G）。

接下来，作者通过植入NAT10敲除、NAT10过表达和控制鼻咽癌细胞的小鼠肿瘤异种移植和转移模型，在体内研究了NAT10促进生长和转移的功能。肿瘤异种模型显示NAT10促进肿瘤体积和肿块生长（图1H，I），免疫组化结果显示NAT10与Ki67呈正相关（图1J-M）。肿瘤转移模型显示NAT10通过生物发光促进鼻咽癌肺转移（图1N，O），肺组织H&E染色显示肿瘤病变与NAT10表达呈正相关（图1P）。作者还发现NAT10促进鼻咽癌细胞体外增殖和转移。综上所述，这些发现提示NAT10介导的ac4C修饰促进鼻咽癌的增殖和转移，并与鼻咽癌的预后有关。

肿瘤的恶性程度、转移程度、复发程度往往与免疫抑制微环境，尤其是T细胞功能不足密切相关。人类鼻咽部表现出多种免疫浸润，先前的单细胞测序研究表明，正常鼻咽部组织主要由T淋巴细胞和B淋巴细胞组成。在炎症的情况下，B细胞在鼻咽组织中更加丰富，而T细胞在鼻咽癌的肿瘤微环境中普遍存在。随着鼻咽癌的进展，肿瘤微环境中T细胞的功能受到明显抑制。为了研究ac4C修饰对NPC免疫微环境的影响，作者分析了TCGA数据库中免疫数据库TIMER2.0中的HNSCC。分析显示，NAT10的表达与T细胞、树突状细胞（DC）、自然杀伤细胞（NK细胞）、B细胞、中性粒细胞和巨噬细胞呈显著负相关（图2A）。此外，为了证实NAT10在NPC中的免疫抑制作用，作者利用CRISPR/Cas9技术培育了NAT10敲除C57BL/6小鼠，命名为C57BL/6 NAT10em1Smoc。对未经处理的C57BL/6和C57BL/6 NAT10em1Smoc小鼠的外周血流式细胞仪面板分析显示，敲除NAT10显著增加CD4+ T细胞、CD8+ T细胞和dc的百分比（图2B-D）。进一步分析C57BL/6和C57BL/6 NAT10em1Smoc小鼠外周血中3万个细胞的T - distributed random Neighbor Embedding（T-sne）亚群，作者发现NAT10敲除组CD4+T细胞和CD8+T细胞显著增加，而dc数量较少且无显著变化（图2E，F）。此外，C57BL/6和C57BL/6 NAT10em1Smoc的外周血特异性t细胞分析结果相同。随后的T细胞杀伤实验表明，NAT10-Cas9鼻咽癌细胞更容易被T细胞杀死（图2G，H）。此外，将人T细胞注入裸鼠尾静脉，皮下植入敲除或过表达或对照的NPC细胞，研究人T细胞与不同类型NPC细胞的相互作用（图2I）。结果显示，鼻咽癌细胞对t细胞杀伤敏感，与对照组相比，敲除NAT10可显著提高鼻咽癌细胞的t细胞免疫（图2J，K）。此外，利用CNE2和C666-1细胞系，作者发现NAT10缺乏增强了T细胞的活力，促进了T细胞向肿瘤中心募集（图2L，M）。

肿瘤细胞分泌T细胞浸润所需的细胞因子，如CXCL9、CXCL10、CXCL16，可有效扩增CD8+ T细胞29趋化因子是一种小分子量（8-14 kDa）的多功能细胞因子，在炎症期间指导免疫细胞向特定组织的迁移中起着至关重要的作用随后，作者研究了是否有其他分泌蛋白受NAT10调控，从而影响肿瘤免疫抑制微环境的发展。在条件培养基中，使用蛋白质阵列对CNE2细胞和C666-1细胞中表达或不表达NAT10 Cas9的一组趋化因子进行定量。结合CNE2和C666-1的交集，作者发现CXCL16是受NAT10影响的最稳定、最显著、最独特的趋化因子（图2N）。此外，ELISA结果显示，在细胞上清中缺乏NAT10后，CXCL16表达显著增加（图2O）。CXCL16在促进t细胞存活和协调CD8+T细胞扩增中起关键作用。CXC- CXCL9和CXCL10作为CXC趋化因子受体3的配体参与肿瘤微环境中TH1、CD8+ T和NK细胞的募集是重要的然后，T细胞和CNE2细胞共培养实验显示，NPC细胞敲除NAT10减少了周围T细胞的凋亡（图2P）。综上所述，ac4C修饰不仅抑制T细胞的募集和功能，还会影响肿瘤微环境中细胞因子的分泌，这可能是T细胞募集的原因，是免疫抑制的一种表现。综上所述，NAT10敲除可促进T细胞和趋化因子活性，从而抑制肿瘤进展。

作者使用对照和NAT10 Cas9 CNE2细胞进行了乙酰化RNA免疫沉淀测序（acRIP-seq）和RNA测序（RNA-seq）的联合分析，以研究NPC中与t细胞募集相关的潜在ac4c修饰mRNA靶点（图3A）。基因表达谱的相关分析显示，181个差异表达基因至少有两倍的变化。其中，61个基因显著下调（图3B）。随后对ac4C修饰的评估显示，在Cas9细胞中，ac4C基序的富集显著减少，尤其是“CXXCXXCXX”基序。此外，作者观察到ac4C位点在翻译起始位点附近聚集，大多数位点位于编码序列内。野生型（WT）组有3448个独特的ac4C修饰峰和2896个独特的ac4C基因，而Cas9组有2850个独特的ac4C修饰峰和2458个独特的ac4C基因。鉴于NAT10作为乙酰转移酶的作用，作者推测WT组中出现的基因可能包含NAT10的真正靶点。作者将acRIP-seq和RNA-seq交联，分析了181个差异表达基因（fold change≥2，FDR<0.05），鉴定出87个下调基因和94个上调基因。该分析确定了28个与Cas9组中ac4C低乙酰化mRNA水平相关的基因。在这些基因中，有10个被鉴定为转录因子或转录辅助因子，占分析基因总数的三分之一以上（图3C）。

基因本体分析显示，ac4C峰降低的基因与多种生物过程有关，包括mRNA转录和细胞生长。结合mRNA和蛋白表达水平分析，发现ac4C显著调控3个基因，包括转录因子CCAAT增强子结合蛋白γ (CEBPG)、转录辅助因子死盒解旋酶5（DDX5）和解旋酶样转录因子（HLTF），它们在抑制NAT10时均能显著下调mRNA和蛋白水平（图3D，E。在NAT10基因敲除后，ac4C修饰丰度降低了CEBPG、DDX5和HLTF的ac4C修饰丰度，正如整合基因组学观察器（Integrative Genomics Viewer）示意图所证实的那样，ac4C修饰峰减少（图3F，G）。此外，RIP实验证实，敲除NAT10可抑制其与CEBPG、DDX5和HLTF rna的相互作用（图3H）。因此，NAT10促进CEBPG、DDX5和HLTF的ac4C乙酰化。

接下来，作者探讨了ac4c介导的CEBPG、DDX5和HLTF调控的潜在机制。作者的研究结果表明，在WT和NAT10 Cas9 CNE2细胞之间，CEBPG、DDX5和HLTF的启动子活性没有显著差异。随后，用放线菌素- d处理WT和NAT10 Cas9细胞以抑制转录。结果显示，NAT10的缺失显著影响了CNE2细胞中CEBPG、DDX5和HLTF mRNA的稳定性，表明NAT10在调节这些基因的转录中起着至关重要的作用。此外，作者还研究了ac4C是否会调节CEBPG、DDX5和HLTF的表达，而不仅仅是mRNA的稳定性。为此，转染了载体或NAT10过表达构建体的WT细胞用L-leucinamide（MG132）处理以抑制蛋白酶体活性，或用环己亚胺（CHX）处理以阻断蛋白质翻译。数据显示，MG132（而非CHX）的存在减弱了NAT10诱导的CEBPG、DDX5和HLTF的表达。这表明NAT10调节的是蛋白质翻译，而不是CEBPG、DDX5和HLTF的蛋白质稳定性或翻译后修饰。阻断蛋白翻译作用下，WT和NAT10 Cas9 CNE2细胞中CEBPG、DDX5和HLTF的半衰期无显著差异，进一步支持了这一发现。综上所述，ac4C乙酰化促进了CEBPG、DDX5和HLTF mRNA的稳定性和翻译。

大多数转录因子对于控制细胞功能和启动特定基因的转录是必不可少的。因此，作者探讨这三种转录因子是否调控NAT10的表达。结果显示，siHLTF处理降低了NAT10水平，而shDDX5和siCEBPG处理无显著差异（图4A）。然而，体外实验证实CEBPG、DDX5和HLTF促进CNE2细胞的增殖和迁移，从而影响鼻咽癌的恶性进展。随后，染色质免疫沉淀（CHIP）实验显示，HLTF特异性定位于NAT10的启动子区域，并在促进NAT10转录中发挥作用（图4B）。此外，荧光素酶报告基因进一步证实，当HLTF结合的NAT10启动子区域发生突变时，HLTF的转录活性被显著抑制（图4C）。考虑到转录因子需要在细胞核中发挥转录调控作用，作者探讨了NAT10是否会影响HLTF进入和退出细胞核。结果表明，过表达NAT10促进了HLTF的核定位，而敲除NAT10则具有相反的作用，促进了HLTF从细胞核中退出（图4D-F）。综上所述，HLTF作为下游靶基因受NAT10调控，同时作为上游转录因子调控NAT10的表达，形成一个正反馈回路（图4G）。

为了进一步探讨CEBPG、DDX5和hTF如何影响T细胞介导的免疫抑制，作者使用CHIPBase和hTF靶点数据库预测它们的下游基因。分析结果显示，CEBPG调控下游基因1300个，DDX5调控下游基因7031个，HLTF没有任何预测结果。NAT10受HLTF的转录调控；因此，作者将先前测序数据中NAT10乙酰化和表达水平变化一致的基因（fold change≥2，FDR<0.05）与CEBPG和DDX5的预期下游靶标进行了比较，并确定HMGB1是唯一的靶基因（图5A）。基于TCGA数据库发现HNSCC中CEBPG、DDX5、HLTF与HMGB1呈正相关。转染DDX5特异性慢病毒短发夹RNA（shRNA）敲低DDX5后，HMGB1表达随之下降（图5B）。正如预期的那样，CEBPG和HLTF的沉默导致HMGB1表达降低（图5C）。通过CHIP实验，作者证实了DDX5和CEBPG存在于HMGB1的启动子区域，而不是HLTF（图5D）。研究广泛探讨了CEBP家族成员与HMGB134的关系；因此，作者专注于DDX5。Western blot分析显示，DDX5在NPC细胞中的表达水平高于NP69细胞。DDX5和HMGB1组织芯片的免疫组化分析显示，DDX5和HMGB1表达上调与鼻咽癌的临床分期、复发、转移及转归有显著相关性（图5E-M）。结合免疫组化评分，作者证实DDX5与HMGB1呈正相关（图5N）。

为了进一步支持NAT10-DDX5- hmgb1轴有助于增强恶性肿瘤的断言，CNE2细胞接受NAT10 Cas9处理，随后用带或不带hmgb1 shrna的过表达慢病毒NAT10或DDX5转导。抑制NAT10可降低鼻咽癌细胞的转移和生长，尽管这些作用被DDX5过表达减弱。同样，DDX5对鼻咽癌细胞增殖和转移的抑制作用被HMGB1抵消。免疫组化分析显示，在鼻咽癌异种移植组中，NAT10、DDX5和HMGB1的表达升高，表明恶性表型加速。综上所述，这些结果表明DDX5和HMGB1的存在对于NAT10对鼻咽癌恶性特征的影响至关重要。

接下来，作者通过静脉注射外源性人T细胞建立裸鼠肿瘤异种移植模型，检测NAT10是否通过分泌HMGB1介导鼻咽癌免疫抑制。这些发现表明，NAT10敲除抑制了鼻咽癌细胞的增殖潜能。然而，慢病毒HMGB1转染后，增殖能力恢复（图6A-C）。作者推测NAT10可能通过分泌HMGB1来逃避免疫细胞的杀伤。研究表明，NAT10通过调节蛋白质（包括HMGB1）和一系列趋化因子的分泌来影响t细胞的数量，进而影响肿瘤微环境内的免疫细胞浸润，从而建立免疫抑制微环境，使免疫细胞能够逃避攻击。尽管免疫检查点阻断疗法已证明对许多癌症患者有显著的益处，但其他问题仍有待解决，包括患者选择标准和开发联合疗法以增强对单一疗法的耐药性或敏感性。因此，作者确定了NAT10是否会影响癌细胞对PD-1免疫检查点阻断治疗的反应。此外，与对照C57BL/6小鼠相比，注射荧光素酶慢病毒的Lewis肺癌细胞系（LLC）在C57BL/6 NAT10em1Smoc小鼠皮下异种移植模型中的增殖能力显著降低（图6D-G）。随后对PD-1阻断治疗有效性的评估显示，NAT10缺陷小鼠的肿瘤对治疗的敏感性增加（图6D-G）。然而，HMGB1过表达使得肿瘤对抗PD-1治疗脱敏，肿瘤体积证明了这一点（图6D-G）。此外，作者分析了小鼠外周血中CD4+和CD8+ T细胞的比例，表明NAT10缺乏增强了T细胞（图6H，I）。这些结果在C57BL/6 NAT10em1Smoc和C57BL/6小鼠皮下移植CNE2细胞模型中得到进一步证实（图6J）。此外，CNE2 oeHMGB1或CNE2 NC与T细胞共培养表明，肿瘤来源的HMGB1促进T细胞凋亡（图6K）。综上所述，这些结果表明NAT10在调节肿瘤细胞对抗PD-1治疗的反应中起作用。

总之，作者阐明了NAT10对鼻咽癌免疫抑制微环境的影响。NAT10是目前唯一已知的ac4C乙酰转移酶，可促进HLTF、DDX5和CEBPG mRNA的ac4C乙酰化。这种修饰主要通过DDX5/HMGB1轴抑制鼻咽癌肿瘤微环境中CD4+和CD8+ T细胞的激活。这些发现为鼻咽癌免疫治疗策略的发展提供了新的见解。

实验方法：

序列基序分析、基因表达数据分析、转录组数据分析、乙酰化RNA免疫沉淀测序和RNA测序、基因表达分析、基因编辑与过表达、RNA稳定性实验、蛋白质稳定性实验、染色质免疫沉淀、荧光素酶报告基因实验、RNA结合蛋白免疫沉淀、细胞培养与处理、细胞增殖与迁移实验、流式细胞术、免疫荧光（IF）和免疫组化（IHC）染色、共培养实验、裸鼠肿瘤异种移植模型、CRISPR-Cas9基因敲除小鼠模型、免疫治疗反应评估

参考文献：

Xie, H., Zhang, K., Yin, H., Zhang, S., Pan, S., Wu, R., Han, Y., Xu, Y., Jiang, W., & You, B. (2025). Acetyltransferase NAT10 inhibits T-cell immunity and promotes nasopharyngeal carcinoma progression through DDX5/HMGB1 axis.Journal for immunotherapy of cancer, 13(2), e010301. https://doi.org/10.1136/jitc-2024-01030