CircTTC13通过抑制铁死亡促进肝细胞癌索拉非尼耐药
肝细胞癌（HCC）的高死亡率主要是由于早期诊断困难以及晚期药物耐药性的发展。许多一线化疗药物会诱导铁死亡。由于circRNA已被证明可以影响肿瘤的发展，我们研究了特定的circRNA是否可以调节HCC中的药物诱导的铁死亡。通过circRNA测序，我们发现了一种新的hsa_circ_0000195（circTTC13），它在HCC组织中高表达。这种过表达与更高的肿瘤分级、更晚期的肿瘤阶段、减少的铁死亡以及更差的总生存率相关。在HCC细胞系和外植肿瘤中，CircTTC13的过表达与增殖率增加、转移能力增强以及对索拉非尼的耐药性有关，同时抑制了铁死亡。相反，CircTTC13的沉默减少了恶性特征并促进了铁死亡。计算机分析、荧光素酶报告基因实验和荧光原位杂交共同表明，circTTC13直接靶向并降低了miR-513a-5p的表达，进而导致SLC7A11的上调。此外，抑制SLC7A11的效果与circTTC13敲低的效果相似，而铁死亡抑制则模拟了circTTC13过表达的效果。在耐药性HCC细胞中，circTTC13和SLC7A11的表达水平很高，而circTTC13的沉默在外植肿瘤中诱导了铁死亡并逆转了索拉非尼的耐药性。这些发现表明，circTTC13通过上调SLC7A11成为HCC进展和药物诱导铁死亡抵抗的关键驱动因素。circTTC13/miR-513a-5p/SLC7A11轴可能是HCC的潜在治疗靶点。本文于2025年1月发表于“Molecular Cancer”（IF=27.7）上。
为了研究circRNA对HCC发生和进展的潜在贡献，我们首先调查了手术切除的HCC组织样本与邻近非癌组织之间circRNA的差异表达。分析结果显示，在HCC和邻近组织之间有95个circRNA存在高度差异表达（图1A和B）。通过将95个差异表达的circRNA与circBase数据库中记录的人类所有circRNA进行比对，我们筛选出在HCC或邻近组织中表达最高的前5个circRNA。在识别出的7个circRNA中（其中有3个重复），我们选择了4个尚未进行过功能研究的，并在另外20对临床样本中验证了其高表达。最终，我们确定hsa_circ_0000195在HCC中差异表达（图1C和D）。与正常人肝细胞系（THLE-2）相比，hsa_circ_0000195在4个人类HCC细胞系（HepG2、Hep3B、MHCC97H、Huh7）中也得到了过表达的确认（图1E）。鉴于hsa_circ_0000195在Hep3B细胞中表达最高，而在HepG2细胞中表达最低，我们决定在Hep3B细胞中敲低hsa_circ_0000195，并在HepG2细胞中过表达它，以便进行后续的功能验证。分别使用发散引物和收敛引物对cDNA和gDNA模板进行PCR。结果表明，TTC13可以从两种DNA模板中扩增出来，而hsa_circ_0000195仅存在于cDNA模板中（图1F）。随后，我们对hsa_circ_0000195的基本特性进行了表征。这种circRNA是通过TTC13基因的第2-4号外显子的环化生成的，这一过程涉及选择性剪接，其特定的反向剪接通过Sanger测序得到了确认。因此，我们将hsa_circ_0000195命名为circTTC13。通过RNase R处理实验（图1H），进一步验证了circTTC13的环状结构，其稳定性则通过放线菌素D实验（图1I）得到了确认。荧光原位杂交（RNA-FISH）显示，circTTC13主要定位于Hep3B细胞的细胞质中（图1J）。接下来，我们展示了circTTC13的高表达与HCC的不良预后相关。总共80例临床HCC样本根据qRT-PCR结果被分为高表达和低表达circTTC13两组，并使用Kaplan-Meier方法比较两组的总生存率（OS）（图1K）。低表达circTTC13的患者组总生存期显著更长。这些发现表明，circTTC13的高表达与HCC的进展和致死性相关。
为了研究circTTC13对HCC预后的影响，我们首先评估了其表达变化对体外细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响。通过shRNA敲低circTTC13显著抑制了HCC细胞系的增殖、迁移以及侵袭能力（图2A-C）。因此，敲低circTTC13降低了关键的恶性特征。此外，活/死细胞染色显示，敲低circTTC13增加了细胞死亡（图2D），这表明circTTC13表达的降低可能会影响HCC细胞的死亡。我们用铁死亡抑制剂Fer-1处理Hep3B细胞，该浓度对细胞活性没有显著影响，结果发现Fer-1能够逆转由于circTTC13沉默导致的细胞活性降低（图2E）。相比之下，使用凋亡抑制剂VZAD、坏死抑制剂NEC-1、自噬抑制剂3-MA或焦亡抑制剂BELNA进行类似处理时，均未观察到这种逆转效果。这表明铁死亡可能是circTTC13影响HCC进展和治疗反应的主要机制。因此，我们进一步研究了circTTC13表达与HCC中铁死亡的相关性。沉默circTTC13的表达显著增加了细胞内活性氧（ROS）的积累（图2F），降低了线粒体膜电位（图2G），提高了细胞内Fe²⁺水平（图2H）。此外，与正常HCC细胞来源的肿瘤相比，来自circTTC13沉默HCC细胞的小鼠肝脏肿瘤生长速度显著减慢（图2I和J）。最后，circTTC13沉默的HCC细胞来源的肿瘤表现出更强的铁死亡特征，表现为谷胱甘肽浓度降低和脂质过氧化物积累增加（图2K和L）。
为了确认circTTC13沉默的抗肿瘤效应以及铁死亡在体内的作用，我们在小鼠中建立了皮下肿瘤模型，通过接种表达sh-NC（对照）或sh-circTTC13（沉默）的Hep3B细胞，并比较了使用载体或Fer-1处理后的肿瘤生长情况。沉默circTTC13显著降低了肿瘤体积和重量，这些效应部分被Fer-1注射逆转（图3A-D）。此外，沉默circTTC13抑制了HCC肿瘤的进展（图3E），下调了铁死亡标志物GPX4的表达，并上调了4-羟基壬烯醛（4-HNE），提高了丙二醛（MDA）水平，并促进了脂质过氧化（图3F）。同样，这些效应部分被Fer-1逆转。这些结果表明，沉默circTTC13在体内促进了铁死亡。
为了探究circTTC13调节铁死亡的具体机制，我们首先利用CircInteractome和CircBank数据库搜索与circTTC13结合位点的miRNA，并确定了两个潜在的候选者：miR-485-3p和miR-513a-5p（图4A和B）。为了验证这些候选miRNA与circTTC13结合的能力，我们在共转染野生型或突变型circTTC13以及靶向miRNA模拟物或阴性对照模拟物的Hep3B细胞中进行了荧光素酶活性实验。结果显示，在miR-485-3p存在的情况下，共转染野生型或突变型circTTC13的细胞荧光素酶活性没有差异，而miR-513a-5p的共转染显著降低了野生型circTTC13的荧光素酶活性，但对突变型circTTC13没有影响（图4C和D）。此外，RNA荧光原位杂交（RNA-FISH）实验（图4E）表明，circTTC13与miR-513a-5p在Hep3B细胞的细胞质中共定位。这些发现表明，circTTC13可以在细胞质中与miR-513a-5p结合并发挥海绵作用，从而改变miR-513a-5p靶基因的表达。接下来，我们利用Starbase、TargetScan和miRDB数据库寻找miR-513a-5p的下游mRNA靶点。通过与FerrDb数据库以及GeneCards中与铁死亡相关的基因进行比对，我们确定了14个潜在的mRNA靶点，它们与铁死亡相关（图4F）。随后，我们使用癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas, TCGA）数据库验证了这14个与铁死亡相关的基因在HCC中的差异表达，并通过Cox回归、LASSO回归、随机森林算法和Kaplan-Meier生存分析对每个基因的预后意义进行了测试。这些分析（图4G-K）表明，在这14个与铁死亡相关的基因中，SLC7A11的高表达与不良预后密切相关。
我们进行了双荧光素酶报告基因实验和免疫荧光-荧光原位杂交（IF-FISH）实验，以验证miR-513a-5p与SLC7A11之间的相互作用。实验结果显示，miR-513a-5p的共转染显著降低了野生型SLC7A11的荧光素酶活性，但对突变型SLC7A11的荧光素酶活性没有显著影响。通过IF-FISH实验，我们发现miR-513a-5p和SLC7A11主要在Hep3B细胞的细胞质中共定位（图5A-C）。基础实验也证实，由于circTTC13的过表达，SLC7A11在基因和蛋白水平上的表达显著上调。相反，circTTC13的敲低导致SLC7A11基因和蛋白表达水平显著下调（图5D和E）。沉默circTTC13抑制了HCC细胞的增殖和侵袭，降低了SLC7A11的蛋白表达，并抑制了铁死亡，而SLC7A11的过表达则逆转了这些效应（图5F-I）。综上所述，这些发现表明circTTC13的促癌效应是通过海绵吸附miR-513a-5p实现的，从而导致SLC7A11表达增加。
接下来，我们研究了SLC7A11抑制剂SSZ是否能够逆转circTTC13过表达对肝脏肿瘤生长和铁死亡的影响。结果显示，circTTC13的过表达显著增加了肿瘤体积和重量，并加速了肿瘤的进展（图6A-E），然而，SLC7A11蛋白的同步下调逆转了这些效应。此外，circTTC13过表达对铁死亡的调节作用也部分被SSZ逆转（图6F-I）。
对化疗药物耐药的癌细胞通常对铁死亡诱导更为敏感。因此，促进铁死亡不仅可以降低癌细胞的基础存活率，还可以增强化疗药物的效果。因此，我们测试了通过沉默circTTC13来促进铁死亡是否能够降低HCC对化疗药物的耐药性。为此，我们建立了一个对索拉非尼耐药的Hep3B细胞系（图7A-D）。与亲本细胞相比，这些耐药细胞中circTTC13的表达显著更高（图7E）。此外，在耐药细胞中敲低circTTC13显著降低了细胞活性，并触发了铁死亡（图7F）。此外，circTTC13的敲低还减少了由耐药Hep3B细胞衍生的肿瘤的体积和重量（图7G-I）。在体内，circTTC13敲低的肿瘤表现出4-羟基壬烯醛（4-HNE）水平升高、亚铁离子和丙二醛（MDA）水平增加以及谷胱甘肽（GSH）水平降低（图7J）。这些发现表明，通过诱导铁死亡，circTTC13的敲低可能逆转索拉非尼的耐药性。最后，SLC7A11在索拉非尼耐药的HCC细胞和组织中表达更高，而在circTTC13被敲低时受到抑制（图7K）。这与沉默circTTC13通过下调SLC7A11来增强索拉非尼敏感性和铁死亡的观点一致。
circTTC13在HCC中高表达，其对铁死亡的调节与HCC的进展和不良预后密切相关。本研究为circTTC13作为HCC的生物标志物和治疗靶点的潜力提供了有力的证据。
数据库分析、生存分析、circRNA测序、基因表达分析、基因编辑与过表达、荧光素酶报告基因实验、RNA-FISH和IF-FISH实验、细胞培养与处理、细胞增殖与迁移实验、铁死亡相关检测、小鼠肿瘤模型、免疫组化
Zhang Y, Yao R, Li M, Fang C, Feng K, Chen X, Wang J, Luo R, Shi H, Chen X, Zhao X, Huang H, Liu S, Yin B, Zhong C. CircTTC13 promotes sorafenib resistance in hepatocellular carcinoma through the inhibition of ferroptosis by targeting the miR-513a-5p/SLC7A11 axis. Mol Cancer. 2025 Jan 27;24(1):32. doi: 10.1186/s12943-024-02224-3