泛癌scRNA-seq联合scATAC-seq筛选CD8+T细胞终末衰竭的关键转录因子

在感染或癌症进展过程中，初始的CD8+ T细胞在抗原识别后被激活并克隆扩增，逐渐分化为细胞毒性效应细胞和少量记忆细胞。然而，癌症进展时，肿瘤浸润性淋巴细胞与肿瘤共存；肿瘤微环境中持续的抗原暴露驱动T细胞抗原受体（TCR）的慢性信号传导，破坏记忆T细胞（TM）向功能耗竭状态的分化，最终促进免疫逃逸。耗竭性T细胞（TEX）在肿瘤中表达高水平抑制性受体、细胞毒性功能受损、增殖能力降低，通常预示着免疫检查点阻断（ICB）疗法和过继细胞免疫疗法的临床结果不佳。CD8+ T细胞耗竭是抗肿瘤免疫的一个关键障碍，该文章通过泛癌scRNA-seq联合scATAC-seq筛选与CD8+ T耗竭相关的转录因子，寻找有望成为改善癌症免疫治疗效果的潜在靶点和生物标志物。该文章于2025年1月13日发表在《Nature Cancer》，IF=23.5。

技术路线：

研究结果：

1. ETV7是决定CD8+T细胞耗竭的关键转录因子

为了系统性研究与 CD8+ T 细胞记忆和耗竭状态相关的转录因子（TFs），研究者分析了来自 21 种癌症类型、316 名患者的 CD8+ T 细胞的泛癌单细胞 RNA 测序（scRNA-seq）数据集（图 1a），并结合单细胞 ATAC-seq 数据集（来自肾细胞癌和基底细胞癌的 CD8+ T 细胞），进一步筛选出结合基序富集在记忆和耗竭基因差异可及性区域的 TFs（图 1a、b）。综合筛选结果，研究者确定了 13 个可能驱动 T 细胞向终末耗竭分化的TFs（BATF、IKZF3、ETV7、ZBED2、BACH1、VDR、ZNF282、PRDM5、ZBTB32、NR5A2、RUNX2、KLF7 和 PRDM1）。对排名前五的 TFs（BATF、IKZF3、ETV7、ZBED2 和 BACH1）进行进一步验证（图 1c、d），它们在耗竭性 T 细胞（TEX）中上调，并与记忆和耗竭基因的表达相关（图 1d、e）。研究者还开发了一种体外终末分化模型，通过持续的抗 CD3 和抗 CD28 刺激诱导慢性 TCR 信号传导，以筛选控制 T 细胞终末分化的TFs（图 1f）。与终末表型相比，记忆基因表达降低，而耗竭基因表达增加。在分化过程中，BATF、IKZF3 和 ETV7 的表达逐渐上调，其中 ETV7 的上调最为显著，而 ZBED2 和 BACH1 的表达则随着分化而下降。基于临床单细胞分析和体外验证结果，ETV7 被确定为调节 CD8+ T 细胞从记忆向耗竭分化的关键 TF。

如果ETV7对决定T细胞终末衰竭的命运至关重要，那么它的表达必然与衰竭有关。作者首先检测了基底细胞癌和黑色素瘤的肿瘤浸润性CD8+T细胞中ETV7的染色质可及性。在终末分化轨迹中，ETV7的染色质状态逐渐开放，尤其是在终末耗竭阶段。与染色质状态分析结果一致，通过对泛癌scRNA-seq数据集的CD8+ T细胞元簇进行均匀流形近似与投影可视化分析（UMAP），研究者发现ETV7表达细胞（ETV7+）在耗竭性T细胞（TEX）群体中富集。此外，在泛癌scRNA-seq数据集中，ETV7+细胞在分化过程中更多地富集于TEX细胞而非记忆性T细胞（TM）。ETV7在TEX细胞中高表达，类似于其他耗竭标记基因，而在表达高水平记忆标记基因的TM细胞中低表达。此外，ETV7+细胞在TEX细胞群体中的频率显著高于TM细胞。进一步分析显示，在泛癌研究以及特定癌症类型（如食管癌和子宫内膜癌）中，ETV7表达水平与记忆评分呈负相关，与耗竭评分呈正相关，表明高ETV7表达与记忆状态向耗竭状态的终末分化相关。

图1 单细胞分析和体外筛选的结合鉴定出ETV7是一个关键的TF，可以将肿瘤浸润性CD8+ T细胞的分化从记忆状态转移到耗尽状态

图2 在不同癌症个体中CD8+ T细胞从记忆到衰竭的分化过程中，ETV7表达增加

2. ETV7在CD8+T细胞从记忆到耗竭分化过程中表达增加

通过比较人类scRNA-seq数据中ETV7+和ETV7−T细胞之间的差异表达基因，研究者发现ETV7+细胞中上调的基因在IFN相关通路中显著富集（图2i），ETV7表达与ISG评分呈正相关（图2j）。这一发现与长期暴露于I型IFN促进慢性感染和癌症中CD8+T细胞耗竭的观点一致。研究者因此假设IFNs可能上调CD8+T细胞中的ETV7表达。在所有类型的IFNs中，只有IFNβ显著增加了ETV7表达。此外，IFNβ处理以时间和浓度依赖性方式增加了ETV7的mRNA和蛋白水平。在人类原代CD8+T细胞和Jurkat细胞中也观察到类似的结果（图2k、l）。TCR激活是T细胞分化的基础。与ETV7表达在TEX细胞中富集的观察结果一致（图2c-h），长时间的TCR刺激（超过24h）显示出预期的但较弱的ETV7表达上调。值得注意的是，与IFNβ相比，TCR激活对ETV7表达的影响较弱且延迟，而IFNβ在24h时就显示出显著且持续的强效作用。这些结果表明，IFNβ可能是调节ETV7的主要因素。总之，ETV7由IFN信号诱导，标志着CD8+T细胞从记忆细胞（TM）向终末耗竭细胞（TEX）的终末分化。

3. ETV7使CD8+T细胞分化偏向耗竭

ETV7属于E26转化特异性（ETS）家族的转录因子，尽管ETV7在脊椎动物中高度保守，但它在小鼠中缺失。为了研究ETV7是否参与T细胞从记忆向终末耗竭的分化，研究者通过CRISPR-Cas9和过表达方法操纵ETV7的表达（图3a）。在人类CD8+T细胞中，ETV7的引入抑制了记忆分化关键基因的表达（图3b），并增加了耗竭基因的表达（图3c）。相反，使用gRNA敲除ETV7可提高记忆基因的表达并抑制耗竭基因的表达（图3b、c）。在小鼠CD8+T细胞中过表达以及在人类CD8+T细胞中敲低ETV7也获得了类似的结果。这些发现与基于人类scRNA-seq数据的相关性分析一致（图2）。研究者进一步研究了ETV7在急性感染和慢性感染病理条件下的T细胞分化效应。为了模拟急性细菌感染，研究者使用了OT-I小鼠（携带识别卵清蛋白（OVA）肽残基257-264表位（OVA257-264）的转基因TCR）。将表达ETV7或载体对照的OT-ICD8+T细胞通过尾静脉注射到CD45.1小鼠中，随后用Lm-OVA感染。ETV7抑制了记忆标记的表达，并在感染后第3天显著增加了耗竭标记的表达。与之前报道一致，记忆和耗竭标记在感染后第3天表达，并在第8天逐渐降至基线水平，随后在TM细胞中保持低水平。如预期所示，研究者观察到ETV7+OT-I细胞在脾脏中的数量少于对照细胞。研究者还使用P14小鼠作为急性病毒感染模型，用LCMVArmstrong感染P14小鼠。将LCMV糖蛋白33-41（GP33）激活的CD8+T细胞从P14小鼠中富集出来，然后将表达ETV7或载体对照的CD45.1P14CD8+T细胞通过尾静脉注射到CD45.2小鼠中，随后用LCMVArmstrong感染。记忆和耗竭标记在LCMVArmstrong感染后第3天表达，并在第8天降至基线水平。值得注意的是，ETV7的引入减少了记忆标记的表达，并显著增加了耗竭标记的表达，尤其是在感染后第3天。此外，ETV7表达显著减少了预耗竭T细胞（TCF1+TIM3−）的数量，并增加了TEX（TCF1−TIM3+）细胞的数量。研究者进一步测试了病毒特异性CD8+T细胞（GP33特异性CD8+T细胞）的动态和功能。在病毒感染过程中，CD8+T细胞经历了一个复杂的分化过程，包括初始激活和扩增、死亡以及TM细胞（病毒特异性）的形成。与之前报道一致，研究者观察到在初始扩增后，GP33特异性P14CD8+T细胞的数量急剧下降。相比之下，ETV7表达显著减少了病毒特异性CD8+T细胞的数量，削弱了这一特征表型。此外，ETV7表达显著抑制了四聚体+细胞的细胞因子产生。因此，根据病毒动力学，ETV7表达增加了LCMVArmstrong的病毒载量。作者还使用P14小鼠模型研究了慢性感染期间CD8+T细胞的分化动力学。在慢性感染条件下，P14细胞中耗竭标记的表达逐渐增加至高水平，而记忆标记的表达则保持在低水平。与急性感染类似，ETV7显著抑制了记忆标记的表达，并显著增加了耗竭标记的表达。与这一发现一致的是，观察到预耗竭T细胞数量减少，而终末耗竭T细胞（TEX）数量增加。此外，ETV7表达减少了病毒特异性CD8+T细胞的数量、病毒载量以及四聚体+细胞的细胞因子产生。这些发现表明，ETV7在急性感染和慢性感染中均具有抑制病毒清除的功能。

作者进一步将研究扩展到人类。在感染急性严重急性呼吸综合征冠状病毒2（SARS-CoV-2）的个体中，CD8+T细胞中较高的ETV7表达显示出较低的记忆状态比例，但较高的终末耗竭状态比例。通过对慢性乙型肝炎病毒（HBV）感染个体的单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据进行分析，作者发现表达较高水平ETV7的CD8+T细胞具有较低的增殖和记忆状态比例，以及较高的终末耗竭评分。这些观察结果共同支持了ETV7可能是一个调节节点，将CD8+T细胞引导至耗竭阶段的观点。

图3 ETV7使CD8+ T细胞从记忆表型分化到衰竭表型

4. ETV7抑制CD8+T细胞的抗肿瘤功能

鉴于ETV7在CD8+T细胞分化为耗竭状态中的关键作用，研究者研究了ETV7是否抑制CD8+T细胞的细胞毒性功能。研究者首先研究了在高到低TCR刺激水平下ETV7对T细胞分化的调节作用。值得注意的是，即使在极低水平的TCR刺激下，ETV7也能促进T细胞耗竭。因此，增殖、细胞因子表达以及杀伤肿瘤细胞的能力均被ETV7表达所抑制，这表明即使在低水平的TCR刺激下，ETV7也能削弱T细胞的功能。此外，ETV7表达增加了CD8+T细胞的死亡率，而通过两种gRNA敲除ETV7可有效促进人类CD8+T细胞的增殖和细胞因子表达，即使在低水平的TCR刺激下也是如此。在人类原代CD8+T细胞中，ETV7过表达抑制了细胞因子表达和增殖，同时增强了细胞死亡（图4a-d）。相反，gRNA敲除ETV7则增强了细胞因子的表达和增殖能力，降低了细胞死亡率（图4a-d）。为了确定ETV7在病毒感染期间对CD8+T细胞命运决定的影响，研究者将表达ETV7或载体对照的P14CD8+T细胞注入小鼠体内，随后用LCMVclone13感染（图4e）。值得注意的是，在LCMVclone13感染后第3天，ETV7抑制了P14CD8+T细胞的增殖并增强了细胞死亡（图4f,g）。这些数据表明，ETV7抑制了CD8+T细胞的效应功能。此外，ETV7缺失增加了抗原敏感性，表明ETV7可能是一个增强T细胞识别和杀伤抗原低表达癌细胞能力的靶点。研究者随后在两种小鼠模型（黑色素瘤B16-OVA细胞和结肠腺癌MC38-OVA细胞）中评估了抗肿瘤功能。将经过OVA肽预处理的OT-ICD8+T细胞（过表达ETV7或载体对照）转移至免疫缺陷且携带B16-OVA或MC38-OVA肿瘤的小鼠体内（图5a）。令人惊讶的是，接受ETV7过表达OT-I细胞的小鼠比对照组小鼠形成了更大的B16-OVA源性肿瘤，并且寿命更短（图5b-d）。此外，表达ETV7的肿瘤浸润性CD8+T细胞表现出记忆表型减少和耗竭表型增加（图5e,f）。相应地，在ETV7过表达的情况下，观察到肿瘤浸润性CD8+T细胞数量减少、细胞因子产生和增殖能力降低、T细胞死亡增加以及肿瘤细胞死亡减少（图5g-k）。类似地，ETV7过表达促进了MC38-OVA源性肿瘤的进展，并诱导了肿瘤浸润性CD8+T细胞的耗竭。此外，耗竭总CD4+T细胞对ETV7的肿瘤促进功能以及CD8+T细胞耗竭的影响较小。这些研究表明，ETV7能够限制CD8+T细胞的抗肿瘤功能。

图4 ETV7控制CD8+ T细胞的命运

图5 ETV7抑制CD8+ T细胞的抗肿瘤功能

5. ETV7小鼠增加肿瘤浸润性CD8+T细胞的耗竭

接下来，研究者通过选择性地将ETV7导入造血干细胞Lineage−Sca1+cKit+（LSK）细胞中，探索了ETV7对体内肿瘤进展的影响。在移植到致死性辐照受体小鼠两个月后，嵌合体在外周血中成熟并被分析（图6a）。尽管存在ETV7表达，但在CD8+T细胞和其他白细胞类型的比例和数量上未观察到异常。如预期所示，ETV7在LSK细胞和成熟的CD8+T细胞中均有效表达（图6b）。在此基础上，研究者用B16肿瘤细胞接种对照组和表达ETV7的小鼠。与对照组小鼠相比，表达ETV7的小鼠显示出B16肿瘤生长更快、肿瘤重量更高以及生存时间更短（图6c,d）。进一步检查发现，肿瘤浸润性CD8+T细胞中记忆基因表达减少，而耗竭基因表达增加，细胞因子分泌也减少（图6e-g）。研究者随后研究了ETV7表达的临床相关性。由于食管鳞状细胞癌（ESCA）显示出ETV7与耗竭之间最重要的相关性，并且在所有癌症类型中ETV7+T细胞的频率最高（图2），研究者收集了ESCA患者的鲜组织以测量ETV7蛋白水平。高水平的ETV7与记忆蛋白TCF1表达减少和耗竭蛋白PD1和TOX表达增加密切相关（图6h）。与研究者的体外和体内数据一致，在ESCA患者中，ETV7mRNA水平与记忆评分呈负相关，与耗竭评分呈正相关，并且随着ESCA的分期增加，ETV7的表达也增加（图6i），这表明ETV7可能通过促进CD8+T细胞的终末耗竭在ESCA的进展中发挥关键作用。由于单细胞RNA测序数据揭示ETV7主要表达在T细胞中，研究者结合了癌症基因组图谱数据库中的批量RNA测序数据和生存信息，以评估ETV7表达的临床结果。关键的是，在ESCA和多种其他实体瘤中，高ETV7表达组的生存率低于低表达组（图6j）。这些发现表明，ETV7的高表达可能导致逃避已知的CD8+T细胞靶点，并且ETV7水平可能是一个预测对免疫检查点阻断（ICB）治疗反应的潜在生物标志物。为了进一步证实这一点，研究者纳入了7名接受新辅助PD1抑制剂治疗的ESCA患者。研究者将这些患者分为ETV7high（n=4）和ETV7low（n=3）两组，并分析了他们的病理反应。

值得注意的是，所有ETV7low组患者发生病理降期，而ETV7high组患者的总体临床分期变化极小（图6k）。此外，在黑色素瘤患者中，ETV7表达水平与ICB治疗的反应呈负相关。这些临床预后分析进一步支持了CD8+T细胞中ETV7的高表达可能限制其在TME中的抗肿瘤功能，并且ETV7可以作为ICB反应的潜在生物标志物。

图6 在ESCA小鼠和个体中，ETV7增加肿瘤浸润性CD8+T细胞的衰竭

6. ETV7驱动转录程序向耗竭状态发展

ETV7能够结合ETS共识序列（GGAA）并调节基因的转录活性，但目前尚不清楚其在T细胞中靶向哪些基因。基于肿瘤样本的单细胞ATAC测序（scATAC-seq）数据，ETV7的结合基序在CD8+T细胞终末分化过程中既存在于开放区域，也存在于闭合区域（图7a、b）。值得注意的是，研究者发现一些包含ETV7结合基序的闭合区域位于记忆标记基因附近，包括TCF7（以及CXCR4、CXCR5和EOMES），而一些包含ETV7结合基序的开放区域则位于耗竭标记基因附近，包括CTLA4和TOX（以及PDCD1、TNFRSF9、HAVCR2、CXCL13和LAG3），这一现象在癌症患者（图7c）和丙型肝炎病毒（HCV）感染患者中均有发现。因此，研究者推测ETV7可能会结合这些记忆和耗竭基因的启动子。为了验证这一假设，研究者通过ChIP-qPCR筛选了TCF7、CTLA4和TOX的闭合和开放区域中包含ETV7结合基序的基因组位点。结果表明，在人类和小鼠CD8+T细胞耗竭过程中，ETV7与这些位点的结合显著增加（图7d）。此外，启动子活性研究表明，ETV7抑制了TCF7启动子的活性，同时促进了CTLA4和TOX启动子的活性（图7e）。与这些发现一致的是，ETV7过表达显著增加了TCF7、CTLA4和TOX的mRNA和蛋白水平（图7f、g）。此外，ETV7下调了记忆基因（如CXCR4、EOMES和CXCR5）的表达，上调了耗竭基因（如CXCL13、LAG3、PDCD1、TIM3和TNFRSF9）的表达。相反，在人类CD8+T细胞中敲除ETV7会使表达模式从耗竭状态转变为记忆状态（图3b、c）。在小鼠黑色素瘤和结肠腺癌中，ETV7的表达导致肿瘤浸润性CD8+T细胞中记忆基因表达减少，而耗竭基因表达增加（图5和6）。为了在临床环境中验证这一发现，研究者分析了多种实体瘤scRNA-seq数据，发现ETV7与记忆基因表达呈强负相关，与耗竭基因表达呈正相关，其中食管鳞状细胞癌的相关性最高。这些结果表明，ETV7作为一个转录节点，通过结合记忆和耗竭基因来调控T细胞终末分化的基因表达。

图7 ETV7在CD8+T细胞中作为转录节点，控制记忆和耗竭基因的表达

7. ETV7缺失改善CAR-T细胞的抗肿瘤治疗效果

CAR-T细胞耗竭是实体瘤治疗效果的主要障碍。在分析了接受抗CD19CAR-T细胞治疗的B细胞恶性肿瘤患者的scRNA-seq数据集后，研究者发现CD8+细胞中ETV7mRNA水平与记忆评分呈负相关，与耗竭评分呈正相关（图8a）。此外，与完全缓解（CR）组相比，部分缓解/疾病进展（PR/PD）组的ETV7表达水平更高，表明ETV7表达水平与接受抗CD19CAR-T细胞治疗患者的反应和预后呈负相关（图8b）。这些数据表明，ETV7可能会抑制CAR-T细胞的抗肿瘤效果。尽管CAR-T细胞治疗在白血病中显示出有希望的结果，但实体瘤的CAR-T细胞治疗仍面临诸多障碍和困难。为了提高CAR-T细胞在实体瘤中的抗肿瘤能力，研究者通过共表达ETV7shRNA生成了抗间皮素（抗MSLN）的CAR-T细胞。结果显示，经过ETV7敲低改造的CAR-T细胞表现出正常的扩增潜力和短期（2.5h）癌细胞杀伤能力。研究者还测量了长期分化（14天）情况，发现ETV7缺失增加了CAR-T细胞的记忆群体比例（图8c）。此外，经过ETV7敲低后，CAR-T细胞的耗竭群体比例和耗竭相关基因表达均有所降低（图8d-f）。因此，ETV7敲低使CAR-T细胞从耗竭状态转向记忆状态。研究者进一步在临床前实体瘤模型中研究了ETV7失活的CAR-T细胞的表现。在免疫缺陷小鼠中植入过表达MSLN的OVCAR8细胞后，通过尾静脉注射转移了带有或不带有ETV7敲低的CAR-T细胞。与对照组CAR-T细胞相比，ETV7缺失的CAR-T细胞显著减缓了肿瘤进展（图8g），并延长了生存期。一致地，ETV7缺失增加了肿瘤浸润性CAR-T细胞的比例，并与PD1+T细胞群体的增加密切相关（图8h-k）。综上所述，这些结果表明，ETV7缺失可以改善CAR-T细胞对实体瘤的治疗效果，这可能为免疫治疗提供了有希望的转化潜力。

图8 ETV7耗竭阻断CAR-T细胞耗竭，改善CAR-T细胞抗肿瘤治疗

结论：

ETV7是决定CD8+T细胞命运的关键转录因子，它通过驱动转录程序向耗竭状态转变，限制了CD8+T细胞的抗病毒和抗肿瘤效能。ETV7在多种人类癌症中表达水平与疾病进展呈正相关，且与免疫检查点阻断治疗的响应性呈负相关，其缺失可显著增强CD8+T细胞和工程化CAR-T细胞在实体瘤中的抗肿瘤效能，因此ETV7有望成为改善癌症免疫治疗效果的潜在靶点和生物标志物。

实验方法：

单细胞RNA测序（scRNA-seq）、单细胞ATAC测序（scATAC-seq）、流式细胞术、CRISPR-Cas9基因编辑技术、慢病毒介导的基因过表达、ChIP-qPCR、荧光素酶报告基因实验、动物模型实验、CAR-T细胞制备与功能测试。

参考文献

Cheng, J., Xiao, Y., Peng, T. et al. ETV7 limits the antiviral and antitumor efficacy of CD8+ T cells by diverting their fate toward exhaustion. Nat Cancer (2025). https://doi.org/10.1038/s43018-024-00892-0