治疗诱导的衰老癌细胞通过促进核糖蛋白1依赖性PD-L1上调促进癌症进展

传统化疗和放疗诱导的癌症衰老以增殖不良、耐药性和衰老相关的分泌表型为特征，因导致癌症复发和形成免疫抑制性肿瘤微环境而备受关注。然而，癌症衰老与抗肿瘤免疫之间的关联尚未完全明了。在这里，作者证明衰老的癌细胞会通过促进PD-L1 的转录和糖基化来提高其水平。本研究证明核糖蛋白1 是癌症衰老过程中PD-L1 糖基化的关键调节因子。通过ER-溶酶体相关降解途径，核糖体蛋白1可降低PD-L1的升高水平，从而增加衰老癌细胞对T细胞介导的杀伤的敏感性。通过降低PD-L1 水平并提高细胞毒性T 淋巴细胞的活性，核糖体1 的消耗可抑制雄性小鼠的肿瘤生长。此外，核糖蛋白1靶向或抗PD-1疗法可减少照射肿瘤中衰老癌细胞的数量，并通过激活细胞毒性T淋巴细胞抑制癌症复发。该研究于2025年1月发表在《Nature Communications》，IF：14.7。

在常规癌症治疗后，当肿瘤体积缩小时，免疫抑制性 TME 很可能会得到缓解。这就提出了一个问题：衰老的癌细胞如何才能躲避 T 细胞的直接攻击，并在没有免疫抑制 TME 的支持下长期存在？从合成 OT 细胞杀伤试验中发现，治疗诱导的衰老癌细胞不易受到 T 细胞的监视。通过电离辐射（IR）照射诱导表达 OVA 的 B16F10 小鼠黑色素瘤球体和细胞衰老，将这些衰老的癌细胞和球形细胞与从 OT-1 小鼠脾细胞扩增而来的 OT 细胞共同培养。评估这些肿瘤球体内的 T 细胞浸润情况（图 1a），并测量癌细胞中的 Caspase-3 活性（图 1b ）。与对照组（Cont）相比，表达 OVA 的 B16F10 癌细胞球体与 IR 诱导的癌症衰老（IR-CS）相比，OT 细胞浸润减少（图 1a_IR-CS），OVA 表达的 B16F10 细胞在 OT 细胞杀伤试验中显示出较低的 caspase-3 活性（图 1b_IR-CS），这表明衰老的癌细胞已经获得独立于 TME 的逃避 T 细胞监控的能力。

众所周知，癌细胞会通过过度表达免疫检查点蛋白来逃避 T 细胞的监控29 ，而最近的报道表明，PD-L1 介导的 T 细胞功能障碍可能是衰老过程中的一个重要机制。事实上，PD-L1 水平在 IR 诱导的衰老球和 H460 细胞中上调（图 1c、d）。进一步研究其他类型应激诱导的癌细胞衰老中 PD-L1 的表达发现在多柔比星（DNA 损伤应激；Doxo-CS）（图 1e）或 PTEN 缺失（非 DNA 损伤应激；PTEN-loss-CS）诱导的癌细胞衰老中，PD-L1 的表达显著增加（图 1f 和补充图 1c_PTEN-loss-CS）。此外，在其他类型的癌细胞中，包括 A549 肺癌、U2OS 骨肉瘤、H1299 肺癌和 HCT116 结肠癌细胞中，也观察到红外暴露诱导细胞衰老后 PD-L1 表达增加（图 1g）。在 PD-L1 基础表达较低（A549 和 U2OS）和较高（H1299 和 HCT116）的细胞中，IR 都能增加 PD-L1 的表达。这些发现表明，癌细胞衰老通常会提高 PD-L1 水平，使衰老的癌细胞能够逃避 T 细胞的监控。

先前的研究表明，放疗和化疗可在治疗后早期因 DNA 损伤和其他细胞应激而提高 PD-L1 的转录水平。与之前的报道一致，PD-L1 mRNA 水平在红外照射后两天内逐渐增加3 到 6 倍。值得注意的是，在红外暴露后的第四天，当细胞衰老变得明显时，PD-L1 mRNA 水平激增至 80 倍（见图 1h）。这意味着 PD-L1 mRNA 的增加可能在衰老晚期更为明显，而不仅仅是红外暴露的结果。为研究独立于红外诱导的 PD-L1 mRNA 上调而扩大 PD-L1 表达的潜在机制，作者在内源性 PD-L1 基因敲除条件下使用 pCI-neo-PD-L1 野生型（WT）-Flag 质粒。该质粒的启动子不受红外诱导应激的影响，因此可以验证细胞衰老对 PD-L1 的翻译后调控（图 1i）。有趣的是，癌症衰老会显著提高外源性 PD-L1 的水平，而 PD-L1 的转录调控却不会影响这一水平。此外，在用环己亚胺（CHX）处理的衰老癌细胞中，PD-L1 蛋白的半衰期明显延长（图 1j），这表明癌症衰老可能会增强 PD-L1 蛋白的稳定性。这些结果表明，转录调控和翻译后调控可能协同导致衰老癌细胞中的 PD-L1 水平升高。

PD-L1 通过细胞内转运系统经由 ER 和高尔基体转运至细胞膜。在功能上，由于与 PD-1 的结合发生在细胞膜上，因此大量与膜结合的 PD-L1 对 T 细胞抑制至关重要。作者仔细研究PD-L1在IR-CS、Doxo-CS和PTEN缺失-CS细胞中的胞内定位，发现与对照细胞相比，衰老癌细胞的ER、高尔基体和细胞膜上的PD-L1信号明显增加（图2a；白色箭头表示ER的位置，黄色箭头表示细胞膜的位置，青色箭头表示高尔基体的位置），表明衰老癌细胞中上调的PD-L1在细胞内主动转运至细胞膜。流式细胞分析证实，衰老细胞中与膜结合的 PD-L1 数量大幅增加（图 2b_IR-CS）。为测量细胞膜上能够与其受体 PD-1 结合的功能性 PD-L1 的数量，使用重组 PD-1-FC 蛋白进行结合试验。结果显示，与对照组相比，衰老癌细胞中 PD-L1 与 PD-1-FC 的结合率明显更高（图 2c_PD-1-FC 绿色）。这些结果表明，癌细胞衰老可以激活上调的 PD-L1 的转运，从而大大提高细胞表面功能性 PD-L1 的水平。

最近的报道表明，细胞衰老过程中蛋白质糖基化谱发生显著变化，因此重点研究癌细胞衰老与 PD-L1 糖基化之间的关系。为确定衰老癌细胞中 PD-L1 糖基化的关键调控因子，作者研究了红外诱导衰老癌细胞产生的微阵列数据集中糖基转移酶及其辅助因子的表达谱。该数据集与之前被鉴定为与 PD-L138 有潜在相互作用的 N-糖基化相关因子进行交叉比对。在红外诱导衰老的H460细胞中，35个N-糖基化相关因子的表达量升高，其中9个与之前被认为与PD-L1相互作用的候选因子相吻合（图2d）。这九个候选因子的表达变化通过热图可视化（图 2e），并通过 qRT-PCR 验证（图 2f）。值得注意的是，9 个候选者中的 4 个 STT3B、DDOST、RPN1 和 RPN2 是 OST-B 复合物的组成成分，与 OST-A 复合物相比，OST-B 复合物对某些类型的未折叠或折叠错误的蛋白质具有更高的亲和力，这意味着 OST-B 复合物表达的增加促进糖基化过程，以应对癌细胞衰老过程中的应激条件。

为评估每个候选基因对衰老细胞中PD-L1转录和蛋白稳定性的影响，用靶向9个候选基因的siRNA转染H460细胞，然后暴露于IR诱导衰老。虽然去除了所有候选基因并不会影响 IR-CS 升高的 PD-L1 mRNA 水平（图 2g），但沉默 OST-B 复合物成分明显降低IR 诱导的 PD-L1 蛋白水平的升高（图 2h）。特别是，沉默 STT3B 和 RPN1 可显著降低 PD-L1 水平（图 2h，RPN1 和 STT3B）。沉默 RPN1 和 DDOST 显示出明显的条带移动，这意味着糖基化异常（图 2h，DDOST 和 RPN1 的红色箭头）。就 RPN2 而言，虽然其沉默降低 PD-L1 的水平，但并没有改变 PD-L1 的带移、稳定性和膜水平（图 2h）。

为研究 RPN1 在衰老癌细胞中作为 PD-L1 糖基化和稳定的潜在关键调控因子的作用，利用癌症基因组图谱（TCGA）的数据集进行一项硅分析。分析的重点是肿瘤和抗肿瘤免疫相关因素，使用基于 R 软件包的程序 TIMER2.040-42 进行。首先使用 Gene_DE 模块比较TCGA 所有肿瘤中肿瘤和匹配正常组织的 RPN1 mRNA 表达水平（图 3a）。结果表明，与正常组织相比，RPN1 mRNA水平在乳腺癌、结直肠癌、胶质母细胞瘤、胃癌和肺癌等不同类型的癌症中都明显升高。随后研究了 PD-L1 和 RPN1 水平与癌症衰老标志物之间的相关性，这些标志物在衰老时转录水平升高，包括基质金属蛋白酶 (MMP)-2/3、白细胞介素 (IL)-6、胰岛素样生长因子结合蛋白 (IGFBP)3/5/7、CDKN1A (p21) 和趋化因子 (C-C motif) 配体 (CCL5)43（图 3b）。有趣的是，热图上显示的斯皮尔曼等级相关值表明，大多数癌症，尤其是乳腺浸润癌（BRCA）、结直肠腺癌（COAD）、皮肤黑色素瘤（SKCM）、胰腺癌（PAAD）和前列腺癌（PRAD）等主要癌症存在正相关。这些结果意味着 RPN1、PD-L1 调控和癌细胞衰老之间可能存在密切关系。

最后，使用细胞组成估算模块生成一个热图表，列出了所有 TCGA 肿瘤中 RPN1 表达水平与 CD8⁺ T 细胞比例之间的 Spearman 相关性。为提高分析的准确性，还分析了干扰素（IFN）-β和缺氧诱导因子（HIF）-1α，已知这两种因子分别与肿瘤中的 CD8⁺ T 细胞免疫正相关和负相关。研究结果表明，与众所周知的抗肿瘤免疫抑制因子 HIF-1α 相似，RPN1 的表达与各种肿瘤类型中的肿瘤浸润 CD8⁺ T 细胞群呈显著负相关（图 3c）。考虑到图 1 和图 2 中显示的结果，对 TCGA 数据库进行生物信息学分析的这些发现表明，RPN1 可能是导致癌症衰老过程中 PD-L1 稳定的一个关键调节因子，可能对肿瘤发生过程和抗肿瘤免疫产生有害影响。

PD-L1 有四个N-糖基化位点：如图 4a（上图）所示，PD-L1 有四个 N-糖基化位点：N35、N192、N200 和 N21917,24。通过比较 WT PD-L1 与其非糖基化形式 4NQ（N35Q、N192Q、N200Q 和 N219Q）PD-L1，可以看出这些位点高度糖基化（图 4a）。暴露于 IR-CS 后，完全糖基化的 WT PD-L1 （50-55 kDa）水平显著增加。转染 RPN1 siRNA 会导致 WT PD-L1 水平下降，并出现明显的糖基化异常带移动。用一种广谱 N-糖基化抑制剂妥尼霉素处理后，WT PD-L1 的条带转移到与缺乏 N-糖基化的 4NQ 突变体（34 kDa）相对应的大小，这证实了妥尼霉素完全抑制 PD-L1 的 N-糖基化。值得注意的是，在所有测试的实验条件下，都没有出现低于 4NQ 突变体大小的条带。进一步转染 RPN1 siRNA 对 4NQ PD-L1 没有影响。这些结果表明，由于 RPN1 的缺失，PD-L1 的条带转移是由异常的 N-糖基化引起的，这进一步表明 RPN1 与 PD-L1 的 N-糖基化过程有关。

为验证这一点，对 PD-L1 进行聚糖结构分析。纯化的 N-聚糖经色谱分离，并使用 nanoLC/Q-TOF MS 系统进行分析。结果显示，RPN1 基因敲除后，PD-L1 的总体聚糖水平下降，进一步说明 RPN1 基因耗竭影响的是总聚糖水平（图 4b），而不是改变 PD-L1 的特定末端聚糖结构（图 4c-g）。虽然 RPN1 并不具有糖基转移酶活性，但其重要作用在于促进底物多肽与 OST 复合物催化域的配位和定位，从而提高蛋白质糖基化的效率和精确度。结合之前的这些报道，这些研究结果支持以下结论：RPN1 主要影响 N-糖基化的早期阶段，促进预组装的聚糖在翻译后立即结合到 PD-L1 多肽中。

为研究 RPN1 缺失对癌症衰老的影响，通过衰老相关的 β-半乳糖苷酶（SA-β-Gal）活性检测（图 5a）研究用三种不同的靶向 RPN1 siRNA 处理的细胞的衰老表型。这些 RPN1 siRNAs 能有效降低 PD-L1 水平（图 5b），但对 IR 诱导的衰老本身没有影响（图 5a）。此外，RPN1 的消耗有效中和了在 Doxo-CS 和 PTEN 缺失-CS 细胞中观察到的 PD-L1 表达的增加（图 5c_Doxo-CS 和 5d_PTEN-loss-CS）。此外，还检测了人类癌细胞系中的 PD-L1 蛋白水平（图 5e），并分析了在 PD-L1 基础水平较高（H1975 和 BT549）或较低（H460、A549 和 HCC827）的癌细胞系中敲除或过表达 RPN1 的效果（图 5f、g）。即使在没有衰老的情况下，敲除 RPN1 也会降低 PD-L1 水平（图 5f），而过表达 RPN1 则会提高 PD-L1 水平（图 5g），这表明 RPN1 在应激和正常条件下对 PD-L1 的稳定都至关重要。在 IR-CS 中消耗 RPN1 会导致细胞表面 PD-L1 水平下降（图 5h_Cont Si + IR-CS vs. RPN1 Si + IR-CS，黄色箭头表示细胞膜位置；以及图 5j）以及 PD-L1 与 ER 标记共定位（图 5h_Cont Si + IR-CS vs. RPN1 Si + IR-CS，黄色箭头表示细胞膜位置；以及图 5j）。5h_Cont Si + IR-CS vs. RPN1 Si + IR-CS，白色箭头表示 ER 的位置）和高尔基体（图 5i_Cont Si + IR-CS vs. RPN1 Si + IR-CS，青色箭头表示高尔基体的位置）。

为确定 RPN1 缺失在衰老癌细胞免疫抑制活性中的作用，作者检测了 PD-1 结合、T 细胞浸润和 T 细胞介导的杀伤活性。RPN1 的耗竭降低膜结合 PD-L1 的 IR-CS 增强水平（图 5j），并持续减少 PD-1 蛋白与细胞表面的结合（图 5k）。去掉 RPN1 后，OT-1 细胞对 B16F10-OVA 球形细胞的浸润率（图 5l）和 OT-1 细胞对 B16F10-OVA 癌细胞的杀伤活性（图 5m）均明显恢复，而 IR-CS 则抑制这些活性。综上所述，这些研究结果表明，RPN1 在通过增加细胞膜上的 PD-L1 水平使衰老癌细胞逃避 T 细胞监控方面发挥重要作用。

具有完整糖基结构的 PD-L1 通过细胞内 ER 至高尔基体转运系统转运至细胞表面。相反，异常或未糖基化的 PD-L1 则通过与 ERAD 相关的蛋白酶体降解和/或溶酶体降解途径降解。为确定 RPN1 在 PD-L1 蛋白的平衡调节中的作用，作者进行了 CHX 追逐试验。发现在用 CHX 处理的 IR 诱导的衰老癌细胞中，RPN1 的耗竭明显降低PD-L1 蛋白的稳定性（图 6a）。溶酶体抑制剂氯喹（CQ）逆转了衰老癌细胞中 RPN1 缺失引起的 PD-L1 下调，而蛋白酶体抑制剂 MG132 对 PD-L1 蛋白水平没有明显影响（图 6b）。这表明，RPN1耗竭对PD-L1水平的影响可能涉及溶酶体降解途径，而不是ERAD。

PD-L1 通过内吞作用在细胞膜上循环；在这一过程中，功能失调的 PD-L1 通过溶酶体途径在形成的内体中降解。Rab5和Rab11是内吞和内质体形成过程中不可或缺的物质，它们的敲除不能恢复去除RPN1的衰老细胞中的PD-L1水平（图6c），这意味着RPN-1调控的途径可能与另一种不同于循环过程的溶酶体降解机制有关。最近的研究表明，某些异常蛋白质会进入溶酶体，并通过 ER 溶酶体相关降解（ERLAD）途径被消除。值得注意的是，IR-CS 增加了序列相似性 134 家族成员 B（FAM134B）（图 6c）的水平，FAM134B 是一种结合 LC3 的 ER 吞噬受体，是 ERLAD 的关键组成部分。当去除 FAM134B 时，去除 RPN1 的衰老细胞中降低的 PD-L1 水平得到恢复（图 6c）。与此相一致的是，免疫荧光（IF）染色也显示，CQ 处理 RPN1 缺失的衰老细胞后，PD-L1 与 FAM134B（图 6d）或 LC3B（图 6e）的共定位增强。此外，在 CQ 存在的情况下，RPN1 缺失显著增加 PD-L1 与溶酶体标志物溶酶体相关膜蛋白 1（LAMP1）的共定位，表明 PD-L1 在溶酶体中的积累（图 6f白色区域）。这些发现表明，在衰老癌细胞中，RPN1 的消耗通过 ERLAD 途径介导 PD-L1 的降解，进一步证明 RPN1 在调节 PD-L1 蛋白平衡中的关键作用（图 6g）。

为验证RPN1 对放疗后肿瘤组织中PD-L1 表达和T 细胞活化的影响，使用免疫功能正常的合成小鼠肿瘤模型进行体内研究。用转染Cont siRNA（Cont si）或RPN1 siRNA（RPN1 si）的CT26 细胞接种BALB/c 小鼠。第10 天，小鼠暴露于12 Gy 剂量的红外照射。然后，如示意图所示，通过瘤内转染给药Cont si 或RPN1 si（图7a_图底）。暴露于红外线后，肿瘤大小明显缩小，第一周内缩小达50%。然而，到照射后第二周结束时，肿瘤又开始生长，几乎恢复到原来的大小。这一趋势在所有样本中都是一致的（图7a_右上图，红线）。然而，值得注意的是，RPN1 si 处理组的肿瘤大小持续缩小，在整个观察期间都没有再生长的迹象（图7a_ 右下图，蓝线）。实验结束时，尽管未接受辐照的Cont si 组和RPN1 si 组的肿瘤大小没有明显差异，但接受IR 处理的Cont si 组的肿瘤明显比RPN1 si 组小很多（图7a_右下图，蓝线）。

与作者提出的机制一致，IR-CS能显著提高肿瘤样本中PD-L1 和RPN1 的水平（图7d、e）。此外，RPN1 si 处理抑制了IR-CS 诱导的PD-L1 表达上调（图7d、e）。与我们的体外实验结果（图5 和图6）一致，肿瘤裂解液的免疫印迹显示，在暴露于IR 的肿瘤中，PD-L1和RPN1 之间存在明显的正相关性（图7f ）。与这些结果一致的是，RPN1的耗竭明显增加CD8⁺ T 细胞在IR-CS 下肿瘤组织中的浸润和活性（如颗粒酶B 的表达所示；GB）（图7g-i），这反过来又促进了衰老肿瘤组织的凋亡（图7j）。

为进一步验证基于T 细胞的RPN1 靶向疗法的疗效，作者测量了IR 与Cont si 或RPN1 si 瘤内转染结合后的肿瘤生长和长期存活率，无论是否有CD8 T 细胞耗竭。结果是，瘤内RPN1 基因耗竭抑制了IR 治疗后的癌症复发（图7k_Cont si + IR-CS + IgG vs RPN1 si + IR-CS + IgG），并大大提高动物的存活率（图7l_Cont si + IR-CS + IgG vs RPN1 si + IR-CS + IgG）。与本研究机制研究一致，用抗CD8 mAb 治疗进行CD8 ⁺ T 细胞耗竭有效地中和了 RPN1 靶向治疗的益处（图7k_RPN1 si + IR-CS + IgG vs RPN1 si + IR-CS + α-CD8 mAb 和图7l_Cont si + IR-CS + IgG vs RPN1 si + IR-CS ⁺ α-CD8 mAb）。这些发现共同表明，抑制RPN1 的表达可以抑制放疗诱导的衰老肿瘤中PD-L1 的增加，从而有可能通过增强抗肿瘤免疫力来防止癌症复发。

图 7 中的结果表明，通过瘤内 siRNA 递送应用 RPN1 靶向治疗可激活肿瘤组织内的 T 细胞免疫并下调 PD-L1。为评估 RPN1 靶向疗法对衰老癌细胞的影响，作者分析 SA-β-Gal 活性和 p21 表达水平，这是癌症衰老的既定标志物。暴露于红外的肿瘤样本显示出 SA-β-Gal 活性和 p21 表达水平的明显增加，而用 RPN1 si 治疗的肿瘤样本则显示出红外诱导的这些参数的显著降低（图 8a-c）。肿瘤裂解液的免疫印迹分析显示，在红外暴露的肿瘤中，p21 和 RPN1 之间存在明显的正相关性（图 8d）。总之，这些结果表明，衰老的癌细胞很可能因 RPN1 缺失引起的 PD-L1 损失而被 T 细胞免疫所消灭。

为进一步探索这一假设，在IR-CS动物模型中分析给予抗PD -1治疗性抗体后的衰老癌细胞群。将CT26细胞植入BALB/c小鼠体内，于接种后第13天进行12 Gy的照射，抗PD -1治疗性抗体通过腹腔注射给药。考虑到适合分析的肿瘤大小和较高的CTL活性，我们在第二次给予抗PD -1抗体后1天进行了采样。有趣的是，与rpn1靶向治疗的结果相似，抗PD -1治疗性抗体治疗组的SA-β-Gal活性（图8f）和p21表达水平（图8g）降低，同时肿瘤内CTL活性增加（图8h-j）。这些结果支持通过PD-L1/ PD -1特异性疗法，T细胞免疫可以有效地靶向和消除辐射诱导的衰老癌细胞。

最后，通过4个月以上的长期观察，评估T细胞免疫与ICB清除衰老癌细胞的相关性及其治疗价值。将CT26细胞植入BALB/c小鼠体内，于接种后第11天进行12 Gy的照射。如图所示（图8k_底部），通过腹腔注射给予抗PD -1治疗性抗体和抗CD8耗竭性抗体。与IR单药治疗组相比，IR联合PD-1阻断组显示出更有效的肿瘤抑制和更长的无复发生存期（图8k， 1 α-PD-1 mAb + IR- cs + IgG），并且联合治疗的这些益处被CD8⁺ T细胞清除抵消（图8k， 1 α-PD-1 mAb + IR- cs + α-CD8 mAb）。这些结果清楚地表明，清除PD - l1阳性衰老癌细胞可以通过T细胞免疫抑制癌症复发，从而增强治疗效果。

综上所述，本研究结果表明，常规疗法可以通过解除抑制T细胞的TME来恢复肿瘤内CTL活性。然而，治疗诱导的衰老癌细胞的PD-L1表达增加；这就创造了一个“保护伞”，可以潜在地保护残留的癌细胞不受CTL监视。少数存活的残余癌细胞可以增殖并重新建立抑制T细胞的TME，导致复发。因此，通过RPN1靶向和/或PD-L1/ PD -1靶向治疗靶向这些表达PD-L1的衰老癌细胞可能成为一种有希望的方法，以提高治疗效果和预防癌症复发（图8m）。

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Hwang HJ, Kang D, Shin J, Jung J, Ko S, Jung KH, Hong SS, Park JE, Oh MJ, An HJ, Yang WH, Ko YG, Cha JH, Lee JS. Therapy-induced senescent cancer cells contribute to cancer progression by promoting ribophorin 1-dependent PD-L1 upregulation. Nat Commun. 2025 Jan 3;16(1):353. doi: 10.1038/s41467-024-54132-1. PMID: 39753537; PMCID: PMC11699195