CARM1介导的OGT精氨酸甲基化通过稳定OGT促进非小细胞肺癌糖酵解

O-GlcNAc糖基化修饰由OGT催化，在调节肿瘤糖酵解中发挥重要作用。然而，OGT调控的机制在很大程度上仍然未知。在这里，我们展示了CARM1在非小细胞肺癌（NSCLC）细胞中感应细胞外葡萄糖水平的变化。增加的葡萄糖上调了CARM1和OGT。CARM1在精氨酸348位置甲基化OGT，通过去泛素化酶USP9X的结合促进其稳定性。OGT的精氨酸甲基化增加了全局O-GlcNAc糖基化水平，从而促进了NSCLC细胞中的糖酵解。OGT的精氨酸甲基化还上调了c-Myc表达，并在体外和体内促进了NSCLC细胞的增殖。OGT表达与人类NSCLC样本中的CARM1呈正相关。当前的研究结果揭示了响应葡萄糖浓度变化通过精氨酸甲基化稳定OGT的机制。该研究还阐明了CARM1-USP9X-OGT轴在NSCLC糖酵解中的作用，为NSCLC提供了潜在的新靶点或治疗策略。本文于2024年12月发表于“Cell Death and Disease”（IF=8.1）上。

为了探索精氨酸甲基化是否涉及响应葡萄糖浓度变化对OGT的调节，我们首先检测了全局O-GlcNAcylation和与细胞外葡萄糖变化相关的精氨酸甲基化。结果显示，O-GlcNAcylation和精氨酸甲基化水平与葡萄糖的变化一致相关（图1A）。在H1299细胞中，内源性OGT被精氨酸甲基化（图1B）。OGT的精氨酸甲基化随着葡萄糖浓度的增加而增加（图1C），并在葡萄糖耗尽时以时间依赖的方式减少（图1D）。这些结果表明OGT被精氨酸甲基化修饰，并且这种修饰是依赖于葡萄糖的。然后，我们旨在确定特定于精氨酸甲基化OGT的PRMT，并发现只有CARM1与OGT强烈相互作用，并且其表达与葡萄糖的变化一致相关（图1E-G）。OGT的精氨酸甲基化与CARM1表达的上调相关（图1H）。用CARM1抑制剂TP064处理以剂量依赖的方式减少了OGT的精氨酸甲基化（图1I），而在体外暴露于外源性CARM1以剂量依赖的方式增加了OGT的精氨酸甲基化（图1J）。这些结果表明CARM1催化了OGT的精氨酸甲基化。

为了确定OGT的精氨酸甲基化位点，我们进行了液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）分析。确定了六个甲基化精氨酸残基（Arg 42/113/321/348/420/973）。为了确定主要的精氨酸甲基化位点，将这六个精氨酸残基替换为赖氨酸，并转入HEK-293T细胞。结果显示，OGT R348K和OGT R973K突变体减少了OGT的精氨酸甲基化（图2A）。为了确定CARM1介导的OGT精氨酸甲基化的特定靶点，我们生成了带有GST标签的OGT缺失突变体（图2B）。GST下拉实验显示，OGT的TPR结构域突变体与CARM1有强烈的相互作用（图2C）。R348位点位于TPR结构域中，而R973位点则不在此结构域，这表明CARM1在R348位点催化OGT的精氨酸甲基化。为了证实这一点，我们进行了体外甲基化实验，结果显示OGT R348K的精氨酸甲基化程度显著低于OGT野生型（WT）（图2D）。此外，TP064处理减少了OGT WT的精氨酸甲基化，但对OGT R348K突变体没有影响（图2E）。此外，葡萄糖饥饿处理减少了OGT WT的精氨酸甲基化，但对OGT R348K突变体没有影响（图2F）。这些结果表明CARM1在R348位点对OGT进行了精氨酸甲基化。

在证实了CARM1在R348位点甲基化OGT之后，我们检查了精氨酸甲基化的作用。我们首先显示，随着葡萄糖浓度的增加，OGT和CARM1一致地上调，并且敲减CARM1抑制了OGT的上调（图3A，B）。类似地，随着饥饿时间的增加，OGT和CARM1同时下调，而过表达CARM1抑制了OGT的下调（图3C，D）。敲减CARM1下调了OGT蛋白表达（图3E），而mRNA水平几乎没有变化（图3E）。此外，TP064处理下调了OGT蛋白表达（图3F）。总的来说，这些结果表明CARM1介导的OGT精氨酸甲基化负责其稳定性。

OGT通过蛋白酶体降解，这使我们假设CARM1通过泛素-蛋白酶体途径调节OGT的稳定性。用蛋白酶体抑制剂MG132处理逆转了CARM1敲减对OGT的抑制效应（图3G），并且CARM1敲减在存在蛋白质合成抑制剂环己酰亚胺（CHX）的情况下减少了OGT的半衰期（图3H）。此外，用TP064处理以剂量依赖的方式增加了H1299细胞中OGT的泛素化（图3I）。这些结果支持CARM1通过减少其泛素化来稳定OGT的观点。因此，我们检查了OGT R348K的甲基化是否有助于OGT的稳定性。我们发现OGT R348K突变体中的泛素化水平高于OGT野生型（WT）和OGT R348F（模拟持续甲基化状态）突变体（图3J）。这些结果表明CARM1介导的OGT R348精氨酸甲基化促进了OGT的稳定。

去泛素化在蛋白质稳定中起着重要作用。我们鉴定了几个USPs家族成员（USP7, USP9X, USP10, USP15），它们可以与OGT结合。我们发现，在敲减USP9X后，OGT的下调最为明显。敲减USP9X显著降低了OGT的蛋白水平，而mRNA水平几乎没有变化（图4A）。MG132逆转了USP9X敲减对OGT的抑制效应（图4B）。此外，USP9X敲减缩短了OGT的半衰期（图4C），并且USP9X敲减后OGT的泛素化增加（图4D）。OGT R348K突变体显示比OGT WT更高的泛素化水平，并且敲减USP9X增加了OGT WT的泛素化，但对OGT R348K突变体没有影响（图4E）。这些结果表明USP9X是OGT的去泛素化酶，并通过OGT R348精氨酸甲基化稳定OGT。接下来，我们检查了OGT的精氨酸甲基化如何通过USP9X影响其稳定性的机制。我们首先通过内源性共免疫沉淀（Co-IP）实验确认了USP9X在H1299细胞中与OGT结合（图4G）。GST下拉实验的结果显示，OGT的TPR结构域突变体与USP9X有强烈的相互作用（图4F）。去泛素化酶USP9X与OGT的相互作用在OGT R348K突变体中减弱（图4H）。此外，TP064处理显著削弱了OGT WT与USP9X之间的结合相互作用，但对OGT R348K没有影响（图4I）。这些结果确认了CARM1对OGT R348的精氨酸甲基化通过促进与USP9X的结合来稳定OGT。

由于OGT的精氨酸甲基化会影响OGT的稳定性，我们进一步研究它是否会影响O-GlcNAcylation。我们发现CARM1的抑制降低了O-GlcNAcylation水平（图5A， B）。与OGT WT和R348F突变体相比，OGT R348K突变体的O-GlcNAcylation水平显著降低（图5C）。TP064处理显著降低了OGT WT中的O-GlcNAcylation，但在OGT R348K突变体中没有（图5D）。我们还研究了OGT甲基化对糖酵解的影响。结果显示，与OGT WT和R348F突变体相比，OGT R348K突变体的乳酸产生和ECAR减少（图5E， F）。TP064抑制CARM1显著降低了OGT WT中的乳酸产生和ECAR，而OGT R348K突变体没有表现出显著变化（图5G， H）。这些结果表明，CARM1对OGT R348的精氨酸甲基化促进了NSCLC中的糖酵解。

研究表明，OGT可以通过增强c-Myc的稳定性来促进细胞增殖。我们发现，与OGT野生型（WT）和R348F突变体相比，OGT R348K突变体中的c-Myc表达水平显著较低（图6A）。OGT WT中的c-Myc表达显著高于OGT R348K突变体，且TP064处理显著下调了OGT WT中的c-Myc表达，而OGT R348K突变体的变化不明显（图6B）。然后我们检查了OGT精氨酸甲基化对NSCLC细胞增殖能力的影响。结果显示，与OGT WT和R348F突变体相比，OGT R348K突变体的细胞增殖率较低（图6C, F）。此外，抑制CARM1在OGT WT中比在R348K突变体中引起的增殖抑制更为显著（图6D, E）。为了评估OGT精氨酸甲基化在体内对NSCLC的作用，将H1299-shOGT 3’-UTR-WT/R348K/R348F细胞皮下注射到裸鼠中。结果显示，注射OGT R348K突变体细胞的裸鼠的肿瘤大小和重量低于注射OGT WT和R348F突变体细胞的裸鼠（图6G, H）。这些结果确认了OGT的精氨酸甲基化修饰促进了NSCLC的增殖。为了探讨OGT和CARM1的临床相关性，在人类NSCLC样本中进行了免疫组化染色。CARM1和OGT在癌组织中的表达高于癌旁组织（图6I–K）。数据分析显示，OGT与CARM1之间的相关性具有统计学意义（图6L）。在NSCLC中，CARM1表达与OGT表达呈正相关。

我们展示了CARM1能够感应细胞外葡萄糖的增加，并在R348位点甲基化OGT，通过促进USP9X的结合来稳定OGT。这导致了糖酵解的增加和c-Myc的上调，从而在体外和体内促进了NSCLC细胞的增殖。CARM1介导的OGT甲基化是NSCLC进展所必需的，去除这种修饰可能为NSCLC的治疗提供一种新策略。

质谱分析、real-time PCR、Western blotting、免疫共沉淀（Co-IP）、GST pull-down、体外甲基化测定、CCK8、克隆形成试验、流式细胞术、免疫荧光、细胞共培养、裸鼠皮下注射模型、免疫组化染色、免疫组化分析

Lin L, Yuan Q, Gu J, Bai G, Cong X, Hu Q, Hou J, Jin X, Liu X, Huang B, Zhang Y, Lu J. CARM1-mediated OGT arginine methylation promotes non-small cell lung cancer glycolysis by stabilizing OGT. Cell Death Dis. 2024 Dec 23;15(12):927. doi: 10.1038/s41419-024-07313-1