肝癌转移新机制：基质硬度调控的外泌体miRNA触发肺部“富糖前转移生态位”

在肝细胞癌（HCC）转移前生态位形成过程中，除了经典特征外，是否还存在其他新的病理特征尚不清楚。我们之前的研究强调了基质硬度增加对肝细胞癌肺转移前生态位形成和转移的贡献。然而，基质刚性增加是否影响糖代谢和肺转移前生态位的供应仍不清楚。在这里，我们揭示了基质刚度调节外泌体miRNA作为主要贡献者在肺转移前生态位形成过程中通过减少肺成纤维细胞的葡萄糖摄取和消耗以及增加血管生成和血管通透性来调节葡萄糖富集的潜在机制。我们的研究结果表明，由基质刚度调节的外泌体miRNA触发的肺转移前生态位的新特征葡萄糖富集对转移性肿瘤细胞的定植和存活以及随后的转移灶生长至关重要。该文章于2025年2月发表在《Nature Communication》，IF：14.1。

参考本研究课题组先前报道的转移前生态位动物模型的诱导方法，我们开发了另一种无瘤小鼠肺转移前生态位模型，以评估高刚度刺激下HCC细胞条件培养基对肺转移前生态位形成的贡献。如图1a的动物实验示意图所示，我们分别从生长在6 kPa和16 kPa底物上的Hepa1-6细胞（命名为L-CM和H-CM）中收集条件培养基（CM），每隔一天通过尾静脉注射到小鼠体内（C57BL/6），诱导具有肺转移前壁龛的无瘤小鼠模型。注射的L-CM和H-CM分别代表正常肝脏和肝硬化背景的HCC肿瘤释放的可溶性因子。考虑到BMDCs募集是肺转移前生态位最突出的特征之一，我们通过流式细胞术评估了不同诱导时间点新鲜肺组织中CD11b+CD45+ BMDCs的募集水平。随着诱导天数的延长，L-CM组和H-CM组CD11b+CD45+ BMDCs的数量均增加。同时，与L-CM组相比，H-CM组在第18、22、26天CD11b+CD45+ BMDCs的募集水平均有所增强，其中第26天BMDCs募集差异最大（图1b、c）。以上结果提示，H-CM可能对HCC肺转移前小环境的形成具有较强的诱导能力。此外，它们使我们能够初步确定第26天的诱导时间点作为成功形成具有肺转移前壁龛的无肿瘤小鼠模型的日子。我们进一步分析了这些动物模型第26天新鲜肺组织中转移前生态位相关基因（Fn、Mmp9、S100a8、S100a9、Bv8）的表达情况，发现H-CM组转移前生态位相关基因的表达水平均显著高于L-CM组（图1d），这与H-CM组BMDCs募集结果一致。同样，我们也观察到纤维连接蛋白（FN）的表达（图1e）和髓源性抑制细胞（MDSCs）的比例（图1f）明显增加，以及H-CM组中效应CD8+ T细胞比例的显著降低（图1g），证实H-CM确实促进了肺转移前生态位的形成。此外，我们还在第26天检测了肺组织血管密度和通透性的分子标记，结果显示，H-CM组CD31表达明显增加，但CD31+区域VE-cadherin覆盖率明显降低（图1h，i），说明H-CM具有更强的促进血管生成和破坏血管完整性的能力。基于两组在BMDCs募集、基质重塑（FN和MMP9）、免疫抑制（MDSCs和CD8+ T细胞）、血管生成和血管渗透（BV8、CD31和VE-cadherin）以及炎症（S100A8和S100A9）方面的显著差异，我们得出结论，与L-CM相比，H-CM显著加速了肺转移前生态位的形成。

除了上述体内研究结果外，我们随后在体外构建了一种反映病理状态下肺组织硬度的凝胶底物（926.18 Pa，肺硬度底物）来培养常驻细胞，然后使用H-CM对这些细胞进行干预，以模拟体内肺转移前生态位环境。我们将6 kPa和16 kPa硬度底物培养的人肝癌细胞的L-CM和H-CM分别用于肺硬度底物培养的肺成纤维细胞，发现与L-CM干预相比，H-CM干预显著上调肺成纤维细胞中FN和MMP9的蛋白水平（图1j），与动物实验结果一致（图1d）。同时，我们观察到H-CM处理后肺成纤维细胞单层表面贴壁的HCC细胞数量明显增加（图1k）。这些结果有力地支持了H-CM通过影响肺成纤维细胞和创造适合肿瘤细胞粘附的土壤在肺基质重塑中的突出作用。另一方面，我们还评估了H-CM对血管内皮细胞（HUVECs）中VEGFR2、ZO-1和VE-cadherin表达的影响，结果显示，H-CM显著提高了VEGFR2的表达，抑制了ZO-1和VE-cadherin的表达（图1l），这表明H-CM具有更强的促进血管生成和损伤血管完整性的诱导能力，这与动物模型的研究结果一致（图1i）。经H-CM处理的HUVEC单层也显示出对FITC-葡聚糖的血管通透性增加（图1m），验证了H-CM可以通过培养血管内皮细胞明显增加血管通透性。总之，体内和体外证据充分表明，HCC细胞在高刚度刺激下释放的条件培养基显著促进肺转移前生态位的形成。

转移靶器官中的常驻细胞（成纤维细胞、血管内皮细胞等）受到肿瘤衍生的可溶性因子的教育，通常参与重塑循环肿瘤细胞定植和存活的有利“土壤”环境。我们之前的研究也表明，HCC细胞在高刚度刺激下分泌的LOXL2可以诱导肺成纤维细胞并招募BMDCs，从而促进肺转移前生态位的形成。葡萄糖作为主要的营养物质，主要满足肿瘤细胞增殖和存活的能量需求，重编程的葡萄糖代谢也被认为是癌症的一个典型特征。肺转移前生态位属于HCC细胞的异位生存部位。转移前生态位的葡萄糖富集可能对支持播散性肿瘤细胞的异位定植、存活和生长至关重要。因此，除了BMDCs募集、基质重塑、免疫抑制、炎症、血管生成和血管通透性等经典病理变化外，我们推测葡萄糖代谢重编程也可能发生在转移前生态位的形成过程中。为了研究高刚度刺激下HCC细胞释放的条件培养基是否调节肺转移前生态位中常驻细胞的葡萄糖代谢，我们参照肺转移前生态位环境构建了上述相同的实验系统，评估葡萄糖转运体和糖酵解酶在常驻间质细胞中的表达变化。结果表明，H-CM干预显著降低了肺成纤维细胞中GLUT1、PFKP、PKM2和HK2的表达，但对SGLT2的表达影响不大（图2a），说明肺成纤维细胞的糖摄取和糖代谢水平均被严重削弱。与此一致的是，2-NBDG摄取和葡萄糖消耗实验也显示，经H-CM处理的肺成纤维细胞的葡萄糖摄取和消耗明显减少（图2b，c）。随后，我们进行了非靶向代谢组学分析，以进一步阐明H-CM对肺成纤维细胞代谢改变的影响，发现H-CM干预导致细胞内糖酵解代谢物（包括葡萄糖6-磷酸）含量显著降低，果糖-6-磷酸、2-磷酸- d -甘油酸和磷酸烯醇丙酮酸，这些差异代谢物也在中心碳代谢途径中富集（图2d）。以上数据均支持H-CM干预有效减弱肺成纤维细胞的葡萄糖摄取和消耗，从而创造一个富含葡萄糖的微环境。为了进一步验证这一发现，我们继续检测葡萄糖转运蛋白和糖酵解酶在具有肺转移前生态位的无肿瘤小鼠模型新鲜肺组织中的表达变化。我们的结果还显示，除了Slc5a2（SGLT2的基因名称）外，糖酵解酶（Pfkp，Pkm和Hk2）和葡萄糖转运蛋白（Slc2a1）的表达水平在H-CM组均显著降低（图2e）。同时，在肺组织水平上，GLUT1的低表达和糖原含量的增加（图2f）也支持了H-CM组糖代谢水平的显著降低和葡萄糖积累的增加。此外，通过培养血管内皮细胞，H-CM诱导的肺转移前生态位的血管通透性和血管生成得到改善（图11，m）也表明肺转移前生态位的葡萄糖供应和聚集增加。这些数据表明，在H-CM诱导的肺转移前生态位形成过程中存在葡萄糖富集的新特征。

为了确定葡萄糖富集是肺转移前生态位的新特征，阐明其病理意义是必不可少的。基于葡萄糖富集有利于提高HCC细胞粘附能力的结果（图2g），并且MDSCs的积累可能部分归因于MDSC分化的增加（图1f），我们合理推测，转移前生态位的葡萄糖富集可能会影响粘附分子的表达，从而促进HCC细胞的粘附，或者增强周围的免疫抑制强度，从而促进其生存和转移。我们重点研究了一种粘附分子，整合素β1，它可以结合基质细胞产生的纤维连接蛋白，并探讨了高糖上调整合素β1表达的潜在机制。AMPK是细胞能量传感器的关键调节因子，据报道，在癌细胞、成肌细胞和足细胞中，AMPK受到高葡萄糖的负调控。为了进一步确定高糖诱导的整合素β1上调是否参与了HCC细胞对肺转移前生态位的粘附，我们使用AMPK激动剂（A-769662）或整合素β1功能阻断抗体（整合素β1 Ab）治疗HCC细胞，观察其粘附变化。结果显示，激活AMPK或阻断整合素β1可明显抑制肝细胞在肺成纤维细胞单层上的粘附（图2h）。因此，肺转移前生态位中葡萄糖富集可通过调节AMPKα/SNX17通路，有效上调HCC细胞表面整合素β1水平，从而促进肿瘤细胞对转移前生态位的粘附。除了细胞粘附特性外，肺转移前壁龛中MDSCs的数量对于循环肿瘤细胞在外源组织中的定植和存活也至关重要。在具有肺转移前生态位的无肿瘤小鼠模型中，我们验证了H-CM在肺转移前生态位中MDSCs积累中的重要作用（图1f）。考虑到MDSCs的积累可能部分归因于MDSC分化的增加，我们继续澄清葡萄糖富集是否影响MDSCs分化。在IL-6和GM-CSF存在下，高糖显著促进骨髓细胞向MDSCs分化，而糖酵解抑制剂（2-DG）干预显著减弱其对MDSCs分化的影响（图2i）。在之前的报道中，mTOR通路的激活可能参与了葡萄糖积累对MDSCs分化和功能的影响。在这里，我们还观察到MDSCs在高糖刺激下mTOR磷酸化水平的增加，但2-DG干预有效地抑制了这种作用（图2j）。总之，转移前生态位中的葡萄糖富集通过AMPKα/SNX17途径显著上调整合素β1的表达，促进HCC细胞对生态位的粘附，也增加了MDSCs的分化，加强了免疫抑制微环境，从而促进了随后的定植和生存，这表明葡萄糖富集是肺转移前生态位的一个新特征。

原发性肿瘤释放的可溶性因子通常包含分泌蛋白、细胞外囊泡（EVs）和其他分子元件。外泌体作为分泌的微泡可以从肿瘤细胞转移到受体细胞中，实现细胞间的信息交换。考虑到葡萄糖代谢重编程发生在细胞内，肿瘤细胞来源的外泌体可能在肺转移前生态位形成过程中调节葡萄糖富集发挥主导作用。我们用差示超离心的方法从H-CM制备了无外泌体的H-CM（H-CM- exo -free），并通过分析外泌体标记包括TSG101、CD63、Hsp70和ALIX来证实其质量。然后，我们分别利用无H-CM- exo和H-CM处理生长在肺坚硬底物上的肺成纤维细胞，结果表明，无H-CM- exo干预显著逆转了H-CM干预对糖酵解酶和葡萄糖转运蛋白的影响（图2k），以及葡萄糖摄取和消耗（图2l，m）。这些数据表明，在H-CM诱导的肺转移前生态位期间，外泌体确实是调节葡萄糖富集的主要因素。

为了进一步验证外泌体在H-CM诱导的肺转移前生态位中调控葡萄糖富集的主导作用，我们采用差分超离心法从L-CM和H-CM中纯化外泌体，分别命名为L-Exo和H-Exo。纯化的外泌体呈现典型的杯状结构（图3a），符合外泌体的典型表型特征。此外，它们的分子标记TSG101、CD63、Hsp70、ALIX均检测到，而阴性分子标记Albumin、Cytochrome C均未检测到（图3b），进一步证实纯化的外泌体质量符合外泌体的特性，可用于下游实验。我们随后使用膜绿色荧光探针（DIO）标记L-Exo或H-Exo来确定受体细胞，发现在DIO标记的外泌体孵卵后，受体细胞（肺成纤维细胞和血管内皮细胞）都有细胞内的绿色斑点（图3c），表明来自HCC细胞的L-Exo和H-Exo可以成功转移到肺成纤维细胞和血管内皮细胞中。由于肿瘤细胞分泌的外泌体动员BMDCs进入次要器官部位，触发转移前生态位的形成，我们利用Millicell悬挂细胞培养插入物构建了模拟转移前生态位环境的体外共培养系统（图3d），以阐明外泌体在转移前生态位形成中的作用。具体来说，BMCs在IL-6和GM-CSF存在下在下腔培养48小时，然后与在肺硬度底物上生长的L-Exo或h-exo处理的肺成纤维细胞在上腔共培养48小时。我们观察到，与L-Exo干预相比，H-Exo干预显著提高了肺成纤维细胞中FN和MMP9的表达，而与BMCs共培养进一步增强了这些作用（图3d）。同时，当BMCs与h-exo处理的肺成纤维细胞共培养时，BMCs向MDSCs分化的数量显著增加（图3e）。H-Exo干预与H-CM干预在体内的结果基本一致，说明H-Exo与H-CM类似，也促进了肺转移前生态位的形成。使用L-Exo或H-Exo处理生长在肺僵硬底物上的肺成纤维细胞，我们进一步检测糖酵解相关蛋白的表达和肺成纤维细胞的葡萄糖摄取能力，以验证它们在葡萄糖代谢中的调节作用。结果显示，H-Exo干预显著降低了肺成纤维细胞中葡萄糖转运蛋白（GLUT1）和糖酵解酶（PFKP、PKM2和HK2）的基因和蛋白表达水平。此外，H-Exo处理也削弱了它们的葡萄糖摄取和消耗能力，与H-CM干预的结果一致（图2a-c），证实了外泌体在葡萄糖代谢中的调节作用。同时，我们发现H-Exo培养的肺成纤维细胞单层表面粘附的HCC细胞数量增加，表明H-Exo通过重塑基质和促进葡萄糖富集，为CTC的粘附和定植创造了有利的“土壤”环境。这意味着H-Exo干预通过改变血管通透性和血管生成，增加了肺转移前生态位的葡萄糖供应和聚集。

为了进一步验证H-Exo对肺转移前生态位形成，特别是葡萄糖富集的贡献，我们在体内建立了H-Exo诱导的肺转移前生态位无肿瘤小鼠模型。与图1a所描述的方法类似，我们每隔一天通过尾静脉分别向C57BL/6小鼠体内注射L-Exo和H-Exo，诱导肺转移前生态位形成（图3f）。在诱导外泌体的第26天，我们收集新鲜肺组织进行后续分析。与H-CM诱导相同，H-Exo诱导也显著促进肺转移前生态位的形成，包括增加CD11b+CD45+ BMDCs的募集，诱导基质重塑，促进肺组织血管生成和炎症（图3g）。我们从游离的肺组织中分离并收集了间质部分液，并检测了无细胞间质部分液中的葡萄糖水平。结果显示，H-Exo诱导小鼠肺组织间质葡萄糖含量高于L-Exo诱导小鼠肺组织间质葡萄糖含量（图3h），表明H-Exo诱导的肺转移前壁龛中形成了葡萄糖富集。此外，对外泌体标志物TSG101、成纤维细胞标志物S100A4（FSP-1）和葡萄糖转运蛋白GLUT1的多重免疫荧光分析显示，h-exo诱导组肺成纤维细胞接受外泌体，其外泌体集中区域的葡萄糖摄取（GLUT1表达）明显降低。此外，H-Exo诱导还通过抑制cd31阳性血管内皮细胞中VE-cadherin的表达来增加血管通透性（图3i），这表明H-Exo增加了葡萄糖供应和聚集。我们继续将Hepa1-6-Luc细胞静脉注射到已建立的动物模型体内（图3f），发现h-exo诱导的富糖肺转移前生态位显著促进了肝癌细胞在体内的定植和肺转移（图3j，k），验证了富糖肺转移前生态位对转移性肿瘤细胞的定植和存活以及随后转移灶生长的促进作用。总之，这些发现表明外泌体不仅介导基质刚度诱导的肺转移前生态位形成，而且在肺转移前生态位形成过程中也是导致葡萄糖富集的主要因素。

由于其对基因表达的高调控作用，外泌体中的miRNA通常被认为是细胞间串扰的重要介质。我们进一步确定了基质刚度调节外泌体中哪些miRNA在肺转移前生态位形成过程中促进葡萄糖富集。我们进行小RNA测序以筛选MHCC97H-L-Exo和MHCC97H-H-Exo之间差异表达的miRNA。以|FC| > 1.5 （FC: fold change）和P < 0.05为阈值，我们共获得了MHCC97-H-Exo中已知的15个差异表达miRNA，包括9个上调miRNA和6个下调miRNA（图4a），我们采用miRNA qRT-PCR随机验证了一些差异miRNAs（let-7d-5p，miR-365a-5p，miR-194-5p，miR-125a-5p）的表达，这些miRNAs在MHCC97H-H-Exo中均表现出显著上调（图4b），表明测序结果的可靠性。而在Hep3B-H-Exo中，除miR-194-5p外，这些miRNA也表现出过表达（图4b）。因此，我们分别将9个上调的miRNA模拟物转染到肺成纤维细胞中，以确定不同miRNA对葡萄糖富集的贡献。糖酵解相关基因分析表明，与其他miRNA模拟物相比，let-7d-5p模拟物对SLC2A1、PFKP、PKM和HK2的表达具有最显著的抑制作用（图4c），这表明H-Exo中的let-7d-5p可能是调节肺成纤维细胞糖代谢最关键的miRNA。另一方面，我们采用慢病毒介导的过表达或RNAi技术构建let-7d-5p过表达或敲低的肺成纤维细胞，然后将其培养在体外反映肺转移前生态位的肺刚度底物上，分析糖酵解相关蛋白的表达。结果表明，let-7d-5p过表达可显著抑制GLUT1、PFKP和HK2的表达，而let-7d-5p敲低可明显改善其表达（图4d）。有趣的是，在let-7d-5p过表达的肺成纤维细胞中，我们观察到PKM在mRNA水平上下降（图4c），但在蛋白质水平上变化不大（图4d）。此外，我们还评估了let-7d-5p对葡萄糖摄取的影响，发现let-7d-5p过表达明显降低了肺成纤维细胞的葡萄糖摄取，而let-7d-5p敲低则提高了肺成纤维细胞的葡萄糖摄取（图4e），验证了let-7d-5p上调对肺转移前生态位形成过程中葡萄糖富集的积极贡献。

为了证实外泌体let-7d-5p对体内葡萄糖富集的贡献，我们通过尾静脉注射let-7d-5p- oe /Exo来建立具有肺转移前壁龛的无肿瘤小鼠模型。与图1a和图3f所描述的方法类似，我们每隔一天通过尾静脉向C57BL/6小鼠体内注射let-7d-5p-OE/Exo或Mock/Exo，诱导肺转移前生态位形成。在诱导外泌体的第26天，我们观察到let-7d-5p- oe / exo诱导小鼠新鲜肺组织中CD11b+CD45+ bmdc的比例显著增加（图4f），这突出了外泌体let-7d-5p在促进肺转移前生态位形成中的重要作用。此外，我们检测了外泌体诱导的肺转移前生态位动物模型肺成纤维细胞（CD45-CD31-CD140a+）的糖代谢，发现与Mock/Exo组相比，let-7d-5p-OE/Exo组肺成纤维细胞的2-NBDG吸收显著减少（图4）。此外，let-7d-5p- oe /Exo给药明显抑制了外泌体诱导的转移前生态位动物模型肺组织中GLUT1、PFKP和HK2的表达（图4h），证实了外泌体let-7d-5p在肺转移前生态位形成过程中葡萄糖富集的突出作用。

我们继续测量外泌体诱导的肺转移前生态位动物模型新鲜肺组织中MDSCs和CD8+ T细胞的比例。体外高葡萄糖促进MDSCs分化的发现反映了MDSCs在肺转移前生态位的积累部分归因于葡萄糖富集（图2i）。因此，葡萄糖富集可能参与强化肺转移前生态位的免疫抑制微环境。为了明确let-7d-5p-OE/ exo诱导的肺转移前生态位动物模型对HCC转移的影响，我们将HCC细胞静脉注射到肺转移前生态位动物模型中，并在第61天（HCC细胞注射后35天）检测两组肺转移的发生情况。结果显示，let-7d-5p- oe /Exo组肺转移瘤的数量和大小显著增加（图4i），验证了外泌体let-7d-5p诱导的富含葡萄糖的肺转移前生态位作为有利的微环境有利于CTC的定植和转移灶的发展。

为了阐明let-7d-5p调节肺成纤维细胞葡萄糖代谢的分子机制，我们使用TargetScan、miRWalk和miRTarBase三种公开的生物信息学工具筛选let-7d-5p的常见候选靶蛋白，获得154种常见候选蛋白（图5a）。在这些候选蛋白中，我们基于以下原因确定HMGA2为let-7d-5p的靶蛋白：（1）HMGA2在let-7d-5p靶蛋白的预测分析中得分最高。（2）TCGA数据库分析显示HMGA2与肺癌和肝癌组织中糖酵解途径呈正相关。考虑到外泌体let-7d-5p进入受体细胞（肺成纤维细胞）相当于受体细胞中let-7d-5p的上调，我们随后用慢病毒感染肺成纤维细胞，以确定let-7d-5p上调或下调对HMGA2表达的影响。结果表明，过表达let-7d-5p可显著抑制HMGA2的蛋白表达，而敲低let-7d-5p可增加HMGA2的蛋白表达（图5b），表明let-7d-5p与HMGA2之间存在负向调控作用。此外，利用TargetScan Human version 8.0的数据，我们观察到在HMGA2 mRNA的3'UTR中存在7个假定的let-7d-5p结合区，并且所有结合区都包含共同序列（图5c）。随后，我们进行了荧光素酶报告基因测定，以明确let-7d-5p是否特异性结合HMGA2 mRNA的3'UTR。图5c的结果显示，与对照组相比，let-7d-5p和HMGA2 3’utr - wt共转染组的荧光素酶活性明显降低，而HMGA2 3’utr -mut组的荧光素酶活性保持不变（图5c），这表明let-7d-5p特异性结合HMGA2 mRNA的3’utr并调节其蛋白表达。这些数据证实HMGA2是let-7d-5p的靶蛋白。我们将HMGA2- oe质粒转染到let-7d-5p过表达的肺成纤维细胞中，进一步验证let-7d-5p是否通过HMGA2调节肺成纤维细胞的糖代谢。正如预期的那样，HMGA2过表达明显增加了对照细胞中GLUT1、PFKP和HK2的表达，也恢复了这些因let-7d-5p过表达而被耗尽的蛋白的水平（图5d）。

HMGA2作为结构转录调节剂调节包括E2F1在内的一些转录因子的活性，HMGA2与Rb相互作用增强垂体腺瘤中E2F1的乙酰化和活性。因此，我们猜测外泌体let-7d-5p可能通过影响HDAC1与Rb-E2F1复合物的分离来调节肺成纤维细胞中E2F1的乙酰化。我们利用免疫沉淀法证实了HMGA2和Rb在肺成纤维细胞核蛋白中的相互作用（图5e）。然后，我们从let-7d-5p过表达或下调的肺成纤维细胞中提取核蛋白，以Rb为诱饵蛋白捕获HMGA2、HDAC1和E2F1。图5f的结果显示，在let-7d-5p过表达的肺成纤维细胞中，HDAC1与Rb的相互作用较多，而在let-7d-5p下调的细胞中，HDAC1与Rb的相互作用较少。同时，HMGA2能够与HDAC1竞争结合Rb，但对E2F1与Rb的结合影响不大（图5f）。除此之外，我们用Rb抗体免疫沉淀核蛋白后，进行了定量实验（ELISA），专门检测捕获蛋白中HDAC1蛋白的水平。我们发现，在具有let-7d-5p-OE的肺成纤维细胞中，HDAC1与Rb相互作用的水平明显增加，而在具有抗let-7d-5p的肺成纤维细胞中，HDAC1与Rb相互作用的水平显著降低，这表明HMGA2上调增加了HDAC1与Rb- e2f1复合物的解离。为了进一步证明let-7d-5p是否可以通过HMGA2调节E2F1的乙酰化，我们采用免疫沉淀法捕获let-7d-5p过表达或下调的肺成纤维细胞核蛋白中的E2F1，检测E2F1的乙酰化水平。我们观察到，在let-7d-5p过表达的肺成纤维细胞中，HDAC1与E2F1相互作用较多，E2F1乙酰化水平较低（图5g）。相反，在let-7d-5p下调的肺成纤维细胞中，与E2F1相互作用的HDAC1较少，E2F1乙酰化增加（图5）。这些数据表明，let-7d-5p上调确实增加了HDAC1与E2F1的结合，从而减弱了E2F1乙酰化水平。转录因子通常通过结合靶基因的启动子序列来调节靶基因的表达53。通过JASPAR数据库分析，我们预测E2F1是一个潜在的转录因子，可以结合到三个糖酵解相关基因的启动子区域，包括SLC2A1、PFKP和HK2。通过ChIP-qPCR，我们证实肺成纤维细胞中SLC2A1、PFKP和HK2启动子上E2F1的占用增加（图5h）。

为了进一步阐明E2F1乙酰化在调节GLUT1、PFKP和HK2表达中的作用，我们使用HDAC1抑制剂TSA治疗let-7d-5p过表达的肺成纤维细胞。TSA干预明显挽救了let-7d-5p过表达导致的E2F1乙酰化降低（图5i），并恢复了靶蛋白GLUT1、PFKP和HK2的表达（图5i）。我们分别将Flag-E2F1（WT）- oe质粒或Flag-E2F1（K117/120/125 R）- oe质粒转染到let-7d-5p下调的肺成纤维细胞或对照细胞中，证实细胞中E2F1蛋白过表达（Supplementary Fig. 5g）。随后的免疫沉淀分析显示，无论在let-7d-5p下调组还是对照组，使用Flag-E2F1（K117/120/125 R）oe质粒的肺成纤维细胞中，E2F1的乙酰化水平均显著低于使用Flag-E2F1（WT）- oe质粒的肺成纤维细胞（图5j）。更重要的是，K117/120/125 R突变明显逆转了let-7d-5p敲低引起的靶蛋白（GLUT1、PFKP和HK2）上调（图5k）。因此，K117、K120和K125确实是E2F1的主要乙酰化位点，其乙酰化水平影响靶蛋白的表达。综上所述，上述证据表明，肺成纤维细胞中基质刚度调节的外泌体let-7d-5p/HMGA2/E2F1乙酰化/GLUT1、PFKP和HK2通路参与了葡萄糖富集的调节。

除了肺成纤维细胞葡萄糖消耗减少对葡萄糖富集的贡献外，血管生成和血管通透性作为转移前生态位的关键特征，也通过增加葡萄糖供应来影响葡萄糖富集。基于上述鉴定的差异miRNA，我们继续确定基质刚度调节外泌体中哪些miRNA在肺转移前生态位形成过程中有效控制血管生成和血管通透性。我们分别将9种上调的miRNA模拟物转染到HUVECs中，分析了不同miRNA对血管生成和血管通透性的贡献。只有miR-365a-5p明显抑制HUVECs中TJP1（ZO-1的基因名称）和CDH5（VE-cadherin的基因名称）的表达（图6a）。此外，miR-365a-5p mimic显著降低了ZO-1和VE-cadherin的蛋白水平，但升高了VEGFR2的蛋白水平，而miR-365a-5p inhibitor则表现出相反的效果（图6b）。我们进一步分析了miR-365a-5p是否会破坏内皮屏障的完整性，促进癌细胞外渗（图6c），发现异位表达miR-365a-5p的HUVEC单层对fitc -葡聚糖和MHCC97H-GFP细胞的渗透性更强（图6d，e）。相反，在HUVEC中敲低miR-365-5p会导致内皮渗漏明显减少（图6d，e）。为了阐明miR-365a-5p在血管生成中的作用，我们进行了体内绒毛膜尿囊膜（CAM）测定和体外试管形成测定。miR-365-1-5p（小鼠miR-365-1-5p序列与人类miR-365a-5p相同）在Hepa1-6细胞中稳定过表达，并收集其条件培养基进行CAM检测。与Hepa1-6-Mock/CM处理的对照组相比，Hepa1-6-miR-365-1-5p-OE/CM处理的CAM血管数量显著增加（图6f）。在体外成管实验中，HUVECs中miR-365a-5p的异位表达也增加了管的数量，而miR-365a-5p的敲低则减少了管的数量（图6g）。这些结果验证了来自HCC细胞的miR-365a-5p（miR-365-1-5p）足以诱导血管内皮细胞并诱导血管通透性和血管生成。

随后，进行体内fitc -葡聚糖通透性测定，以评估外泌体miR-365a-5p对血管通透性的影响。每隔一天通过尾静脉注射外泌体，持续26天。与PBS或Mock/Exo组相比，miR-365-1-5p- oe /Exo组中的FITC‐葡聚糖更容易从肺血管外渗（图6h，i），这意味着外泌体miR-365-1-5p可以通过培养血管内皮细胞来破坏肺血管完整性。同时，miR-365-1-5p- oe /Exo组肺组织中CD31表达增强（图6j，k）。上述结果表明，外泌体miR-365a-5p（miR-365-1-5p）有助于肺转移前生态位的血管生成和血管通透性。

使用三种公开可用的生物信息学工具（TargetScan、miRWalk和miRTarBase），我们获得了miR-365a-5p的97个常见靶蛋白（图7a）。在这些候选靶蛋白中，我们选择TRPC4AP作为miR-365a-5p的靶蛋白，是因为钙内流对血管功能的影响很大，而且在TCGA分析中，TRPC4AP与TJP1（ZO-1的基因名称）或CDH5（VE-cadherin的基因名称）呈正相关如图7b所示，miR-365a-5p模拟物显著下调TRPC4AP的表达，而miR-365a-5p抑制剂在HUVECs中显著上调TRPC4AP的表达，表明miR-365a-5p与其靶蛋白TRPC4AP之间存在负调控作用。此外，荧光素酶报告基因检测显示，在TRPC4AP 3’utr - wt和miR-365a-5p mimic共转染的细胞中，荧光素酶活性显著降低，但在TRPC4AP 3’utr -mut和miR-365a-5p mimic共转染的细胞中，荧光素酶活性保持不变（图7c），进一步验证了miR-365a-5p对TRPC4AP表达的特异性调节作用。TRPC4AP是一种钙离子通道相关蛋白，可与TRPC4相互作用，增强储存操作的Ca2+进入并增加细胞内钙。为了揭示miR-365a-5p是否调节trpc4ap诱导的Ca2+内流，我们使用Ca2+敏感染料Fluo-4 AM检测转染miR-365a-5p模拟物或抑制剂的HUVECs中的Ca2+内流。我们发现miR-365a-5p模拟物显著降低了HUVECs细胞内Ca2+的荧光强度，而miR-365a-5p抑制剂明显提高了荧光强度（图7d），这表明miR-365a-5p可以抑制TRPC4AP的表达，减少HUVECs中的钙内流。

随着细胞内钙离子浓度的增加，CaMKII（一种多功能丝氨酸/苏氨酸激酶）经常被激活磷酸化下游分子，如MAPK、AMPK、AKT和SRC。在一份报告中，抑制CaMKII可以通过MEKK3/MEK5/ERK5信号通路逆转piezo1诱导的原发性HUVECs中KLF2/4的表达。KLF2通常通过抑制VEGFR2的表达负向调节血管生成，而KLF4则通过激活ZO-1和VE-cadherin表达参与维持血管完整性。因此，我们推测miR-365a-5p通过抑制CaMKII/ERK5通路逆转trpc4ap激活的KLF2/4表达。我们检测了CaMKII/ERK5/KLF2/4在具有miR-365a-5p模拟物或抑制剂的HUVECs中的激活状态，发现miR-365a-5p模拟物显著抑制CaMKII和ERK5的磷酸化水平以及KLF2和KLF4的表达水平（图7e）。相反，miR-365a-5p抑制剂明显逆转了上述变化（图7e），表明miR-365a-5p确实通过抑制TRPC4AP来破坏CaMKII/ERK5/KLF2/4的激活。接下来，我们将TRPC4AP- oe质粒转染到具有miR-365a-5p模拟物的HUVECs中，并进一步确定miR-365a-5p是否通过灭活TRPC4AP/Ca2+/CaMKII/ERK5/KLF2/4途径增加血管生成和血管通透性。如图7f所示，miR-365a-5p mimic显著增加了VEGFR2的表达，降低了ZO-1和VE-cadherin的表达，而TRPC4AP上调阻止了miR-365a-5p在CaMKII/ERK5/KLF2/4通路中的失活作用（图7f）。值得注意的是，KLF4沉默减弱了miR-365a-5p抑制剂对ZO-1和VE-cadherin表达的促进作用（图7g），KLF2沉默逆转了miR-365a-5p抑制剂对VEGFR2表达的抑制作用（图7h）。总的来说，外泌体miR-365a-5p抑制TRPC4AP表达，使CaMKII/ERK5/KLF2/4信号失活，从而促进血管生成和血管通透性。

基质硬化主要是由于I型胶原（COL1）等细胞外基质蛋白过度沉积和交联所致。赖基氧氧化酶（LOX）能有效提高细胞外基质蛋白的交联水平。因此，COL1和LOX的表达水平常被用来指示肝基质僵硬程度。以肿瘤组织中COL1和LOX的中位数表达为阈值，将HCC患者分为两组：COL1low/LOXlow组（低刚度组，24例）和COL1high/LOX high组（高刚度组，24例）。我们通过FISH检测肝癌组织中let-7d-5p和miR-365a-5p的表达，发现COL1high/LOX high组中let-7d-5p和miR-365a-5p的表达水平均明显高于COL1low/LOX low组（图8a，b），表明基质硬度与let-7d-5p或miR-365a-5p表达呈正相关（图8a，b）。接下来，我们分析COL1/LOX表达与临床病理指标如肿瘤大小、结果发现，COL1high/LOX high组HCC组织中let-7d-5p和miR-365a-5p水平较高，肿瘤分化程度较差，COL1high/LOX high组HCC患者肿瘤复发率较高。生存分析显示，COL1high/LOX high组HCC患者的总生存期（OS）和无病生存期（DFS）较差（图8c）。根据let-7d-5p和miR-365a-5p的中位表达水平，我们进一步将HCC患者分为let-7d-5p low/miR-365a-5p low组（16例）和let-7d-5p high/miR-365a-5p high组（16例）。我们发现let-7d-5p high/miR-365a-5p high组HCC患者在生存分析中有不利的OS和DFS（图8d）。在TCGA肝癌患者队列中，我们还发现let-7d- high/ miR-365a- high表明不利的OS和DFS。因此，这些数据表明，HCC组织中高基质刚度与let-7d-5p或miR-365a-5p表达增加密切相关，与细胞实验结果一致。高基质刚度和高表达let-7d-5p/ miR-365a-5p能更好地预测HCC患者预后不良及肿瘤复发。

总之，本研究提出，葡萄糖富集是由基质刚度调节的外泌体miRNA引发的肺转移前生态位的新特征，对于HCC细胞的定植和存活以及转移灶的形成至关重要。据我们所知，这是第一篇探讨基质硬度对HCC中葡萄糖富集的肺转移前生态位形成的影响及其相关机制的报道。本研究结果将丰富和更新肿瘤转移前生态位理论，为今后肿瘤转移前生态位的干预提供新的方向。

小RNA测序、荧光素酶报告基因测定、ChIP-qPCR、TargetScan、miRWalk和miRTarBase分析、TCGA数据库分析、代谢组学、慢病毒介导的过表达或RNAi技术、qRT-PCR、miRNA qRT-PCR、Western blot、双荧光素酶报告试验、ELISA、细胞培养、共培养、细胞死亡检测、葡萄糖摄取和消耗试验、细胞粘附试验、跨内皮浸润试验、细胞内Ca2+测定、流式细胞术分析、鸡胚绒毛膜尿囊膜、试管形成试验、小鼠实验、肺组织解离和单细胞悬液分离、外泌体分离、鉴定和跟踪、葡萄糖、抑制剂、激动剂和功能阻断抗体的干预、骨髓细胞（BMCs）的分离和分化、FITC-葡聚糖漏性试验、苏木精-伊红（HE）和周期性酸-希夫（PAS）染色、免疫荧光共聚焦成像、病理切片、免疫组化分析

Zhao, Y., Yu, H., Li, J., Qian, J., Li, M., Zhang, X., Wang, M., Wang, Y., Dong, Y., You, Y., Zhou, Q., Gao, D., Zhao, Y., Liu, B., Chen, R., Ren, Z., Wang, Z., Zhang, K., & Cui, J. (2025). A glucose-enriched lung pre-metastatic niche triggered by matrix stiffness-tuned exosomal miRNAs in hepatocellular carcinoma. Nature communications, 16(1), 1736. https://doi.org/10.1038/s41467-025-56878-