活化的 AXL 通过抑制 ER 应激和线粒体相关凋亡改善酒精相关性脂肪肝缺血再灌注损伤

        肝脏缺血再灌注（I/R）损伤会导致肝移植和肝切除术的预后不良，尤其是酒精相关性肝病（ALD）患者。细胞凋亡与肝损伤的不同阶段密切相关，内质网（ER）和线粒体平衡紊乱导致的肝细胞死亡可能是肝损伤的关键。由基因axl 编码的受体酪氨酸激酶AXL 是TAM（TYRO3、AXL和MERTK）家族的成员，它通过与生长停滞特异性蛋白6（Gas6）的配体结合参与各种生物过程。然而，AXL是否参与细胞凋亡通路，以及其在肝脏I/R 损伤中的具体机制仍不清楚。在本研究中，作者发现在肝移植的人肝组织中，I/R后总AXL 上调，而磷酸化AXL（p-AXL，AXL的活性形式）下调。同样，在小鼠肝脏I/R 损伤过程中，发现总AXL 上调，而p-AXL 下调。在小鼠肝脏I/R 损伤过程中，Gas6的预处理增加p-AXL的表达，减少ER 应激相关的细胞凋亡，减轻肝损伤，并恢复ER和线粒体的超微结构。此外，通过ALD模型发现ALD小鼠的p-AXL水平较低，更容易受到肝脏I/R损伤。重要的是，活化的AXL通过抑制IRE1和PERK通路来减少ER应激相关的细胞凋亡，从而改善肝损伤。总之，活化的AXL通过抑制ER应激和线粒体相关的细胞凋亡，保护酒精相关性脂肪变性肝脏免受I/R损伤。该研究于2025年1月发表在《International Journal of Biological Sciences》，IF：8.2。

技术路线：

主要研究结果：

1.肝脏 AXL 的磷酸化在 I/R 损伤期间下调

        为了研究总AXL/p-AXL在手术缺血条件下是否失调，以及它们是否参与了人类肝脏I/R损伤，检测它们在供体移植物肝脏活检组织和对照组中的表达情况。结果显示，供体肝脏中总 AXL 的表达水平高于对照组，而 p-AXL 的表达趋势则相反（图 1A-C）。为了探讨肝脏 I/R 期间总 AXL/p-AXL 的变化趋势，我们构建了缺血 60 分钟后不同再灌注时间的小鼠模型。小鼠血清中的肝酶（ALT/AST）水平在I/R损伤后6小时前逐渐升高，之后随着时间的推移逐渐恢复（图1D）。同样，AXL的总表达也在6小时达到峰值，然后逐渐恢复到基础水平。在此过程中，p-AXL 的表达在 6 h 时最低（图 1E&F）。同时，我们在体外对原代肝细胞进行 OGD/R 处理，总 AXL/p-AXL 的表达与小鼠肝 I/R 期间观察到的趋势相同（图 1G&H）。令人印象深刻的是，检测肝脏 I/R 小鼠血清中的可溶性 AXL（sAXL）发现 sAXL 大大升高。可溶性 AXL 是总 AXL 的裂解产物，没有生理活性，但可以竞争性阻断 AXL 受体。这一结果为肝脏 I/R 期间总 AXL 的增加和 p-AXL 的减少提供了解释（图 1I）。因此，在肝脏 I/R 期间，AXL 的磷酸化会减少。

图1.肝脏AXL 的磷酸化在I/R 损伤期间下调

2.活化的 AXL 通过抑制细胞凋亡防止肝脏 I/R 损伤

        为探讨AXL抑制是否会导致I/R损伤及其详细机制，使用外源性rmGas6腹腔注射激活AXL。与人体样本的研究结果一致，肝脏 I/R 小鼠体内 p-AXL 的表达量减少。当用rmGas6激活AXL时，p-AXL水平的升高表明AXL被激活了（图2A）。与假手术组相比，肝I/R损伤导致肝损伤和血清中ALT和AST水平升高，而注射rmGas6可逆转这些影响。同样，AXL 的特异性抑制剂 R428 会显著加剧肝坏死面积以及 ALT 和 AST 血清水平的升高（图 2B-D）。此外，肝脏 I/R 小鼠体内促凋亡蛋白裂解的 Caspase-3（Caspase-3 的活性形式）水平升高，而使用 rmGas6 预处理可逆转这些趋势。肝组织切片的TUNEL检测和裂解的Caspase-3免疫组化染色也证实，活化的AXL通过抑制体内细胞凋亡保护肝脏免受I/R损伤（图2E-H）。这些数据表明，激活 AXL 可通过抑制细胞凋亡保护肝脏免受 I/R 损伤。

图2.活化的AXL 通过抑制细胞凋亡防止肝脏I/R 损伤

3.活化的 AXL 可减轻肝脏 I/R 损伤过程中的 ER 应激和线粒体相关凋亡

        为进一步研究AXL是否会影响肝脏I/R过程中的ER，用TEM检测肝组织的超微结构。发现ER 在 I/R 后出现异常，扩张、空泡化和片状折叠管状结构消失。rmGas6预处理组的损伤得到缓解，ER结构相对完整，而R428则加剧IR诱导的损伤（图3A）。Western 印迹结果显示，BiP、CHOP 和裂解的 Caspase-12（Caspase-12 的活性形式）水平上调，这表明肝 I/R 导致 ER 应激及其相关的细胞凋亡。然而，rmGas6预处理逆转了这些影响，R428预处理加重IR诱导的过度ER应激和细胞凋亡（图3B&C）。肝组织 CHOP 染色免疫组化也表明，rmGas6 预处理可抑制 CHOP 上调，从而减轻肝损伤（图 3D）。在真核细胞中，有三种ER跨膜蛋白介导典型的UPR：两种激酶IRE1和PERK，以及转录因子前体ATF6。至于细胞凋亡效应，前两个激酶 IRE1 和 PERK 主要参与其中。Western 印迹分析发现，肝脏 I/R 使磷酸化-IRE1（p-IRE1，IRE1 的活性形式）及其下游效应物 XBP1s、磷酸化-PERK（p-PERK，PERK 的活性形式）及其下游 ATF4 水平升高，而 rmGas6 预处理可逆转所有这些趋势（图 3E）。因此，这些研究结果表明，活化的AXL可抑制ER应激中UPR的IRE1和PERK分支，从而保护肝脏免受I/R损伤。值得注意的是，TEM 观察到的超微结构变化也表明 I/R 后线粒体肿胀和嵴模糊，而活化的 AXL 也能显著恢复线粒体的超微结构（图 3A）。作为内源性凋亡的经典途径，作者还研究了 p-AXL 是否在线粒体相关凋亡中发挥作用。结果显示，在小鼠肝脏 I/R 损伤过程中，活化的 AXL 可抑制裂解的 Caspase-9（Caspase-9 的活性形式）和 Bax 的水平，同时增加 Bcl-2 的表达（图 3F&G）。所有这些都证实，激活AXL可减轻肝脏I/R损伤过程中的ER应激和线粒体相关的细胞凋亡。

图3.活化的AXL 可减轻肝脏I/R 损伤过程中的ER 应激和线粒体相关凋亡

4.在体外 OGD/R 过程中，激活 AXL 可减轻 ER 应激和线粒体相关肝细胞凋亡

        与图 3 所示的体内实验一致，OGD/R 诱导的 ER 应激导致终末 UPR 信号（如 BiP、CHOP 和 Caspase-12）反应，而 rmGas6 在体外的预处理可减轻这种反应（图 4A）。熊去氧胆酸（TUDCA）是一种公认的ER应激抑制剂，它能以剂量依赖的方式充分阻断OGD/R处理的肝细胞中的ER应激反应（图4B）。正如预期的那样，用 rmGas6 激活的 AXL 能显著抑制体外经 OGD/R 处理的原代肝细胞中 p-IRE1、XBP1s、p-PERK 和 ATF4 的水平（图 4C）。用 rmGas6 预处理的效果与 TUDCA 相似，而且 TUDCA 的应用逆转了 R428 的有害影响（图 4D）。此外，rmGas6预处理通过降低体外OGD/R诱导的线粒体相关肝细胞凋亡中裂解的Caspase-9和Bax的表达，同时提高Bcl-2的水平，阻碍了OGD/R诱导的线粒体相关肝细胞凋亡（图4E）。此外，原代肝细胞中 JC-1 的免疫荧光染色也表明 OGD/R 期间线粒体膜电位（MMP）降低，表现为 JC-1 聚集体（红色荧光）减少，JC-1 单体（绿色荧光）增加。值得注意的是，rmGas6 预处理可恢复 MMP，这也表明活化的 AXL 可减轻肝 I/R 损伤期间线粒体相关的细胞凋亡（图 4F）。此外，流式细胞术检测证实，rmGas6 和 TUDCA 预处理均可减少 OGD/R 诱导的线粒体凋亡（图 4F）。此外，流式细胞术检测证实，rmGas6 和 TUDCA 预处理均可减少 OGD/R 诱导的细胞凋亡（图 4G）。这些结果进一步验证 p-AXL 在原代肝细胞 OGD/R 过程中抑制 ER 应激和线粒体相关的细胞凋亡。

图4.在体外OGD/R 过程中，激活AXL 可减轻ER 应激和线粒体相关肝细胞凋亡

5.ALD小鼠肝脏中磷酸化AXL下调，对I/R损伤的易感性增加

        一些接受肝切除术的患者或患有ALD的供体出现肝切除术后肝功能衰竭的风险较高，因为这两种情况都会加重I/R损伤。因此，采用慢性加暴饮暴食酒精（Gao-binge）喂养，然后进行I/R手术的方法来研究乙醇相关脂肪变性的肝脏I/R损伤（图S2A）。观察到 ALD 小鼠肝脏的宏观变黄、肿大和龟甲纹细节（图 S2B）。组织病理学研究显示，与等热量配对饲养的小鼠（配对组）相比，ALD 小鼠（ALD 组）出现了明显的微小骨质疏松和大骨质疏松，以及肝细胞气球化（图 5A）。油红 O 染色也证实了ALD 小鼠严重的肝脏脂肪变性和脂质堆积（图 5B）。ALD 小鼠血清中的 ALT/AST 水平也有所升高（图 5C）。免疫组化染色显示，在大量长期饮酒导致的终末期肝病患者的肝脏中，p-AXL 的表达下调（图 5D）。Western 印迹证实 p-AXL 水平在 ALD 小鼠肝脏（图 5E）中下调。此外，与配对组相比，TEM 显示 ALD 小鼠肝脏中有脂滴、相对扩张的 ER 管腔、肿胀的线粒体和模糊的嵴（图 5F）。更重要的是，与配对组相比，ALD小鼠在I/R后出现了更严重的肝损伤，坏死面积更大，血清转氨酶（ALT/AST）水平更高（图5G&H）。此外，与Pair组相比，ALD小鼠肝脏I/R后p-AXL水平下调，而裂解的Caspase-12、裂解的Caspase-9和裂解的Caspase-3的表达水平显著上调（图5I）。TEM显示，与Pair组相比，ALD小鼠肝脏中的ER扩张、线粒体肿胀和空泡变性更为严重（图5J）。总之，这些研究有力地证明酒精相关肝病诱导ER应激和线粒体相关凋亡，增加小鼠肝脏对I/R损伤的易感性，而p-AXL可能参与发病机制。

图5.ALD小鼠肝脏中磷酸化AXL下调，对I/R损伤的易感性增加

6.通过减少 ALD 小鼠的 ER 应激和线粒体相关凋亡，激活 AXL 可减轻肝脏 I/R 损伤

        如上所述，ALD 小鼠因ER 应激和线粒体相关凋亡而遭受更严重的肝脏 I/R 损伤。接下来研究活化的 AXL 对 ALD 小鼠的 I/R 损伤是否也有保护作用。rmGas6预处理可减轻红外诱导的肝损伤，这表现在坏死面积减少（图 6A&B）和血清转氨酶水平（ALT/AST）降低（图 6C）。此外，用 rmGas6 预处理可减轻 ALD 小鼠肝脏 I/R 损伤过程中线粒体相关的细胞凋亡（图 6D），还可减少 ER 应激相关的细胞凋亡（图 6E）。此外，TUNEL也表明，AXL的激活减少了IR诱导的小鼠肝组织凋亡（图6F）。此外，TEM直观地显示，rmGas6预处理有助于ER和线粒体从肝脏I/R损伤中恢复。相反，用 R428 抑制 AXL 会加剧 ER 的扩张和细胞凋亡，从而大大加重肝脏 I/R 损伤（图 6G）。综上所述，这些研究为活化的AXL在ALD小鼠肝脏I/R损伤过程中抑制ER应激和线粒体相关凋亡的保护作用提供了实验证据。

图6.通过减少ALD 小鼠的ER 应激和线粒体相关凋亡，激活AXL 可减轻肝脏I/R 损伤

结论

        综上所述，本研究表明，激活 AXL 可抑制 ER 应激和线粒体相关的细胞凋亡，从而保护酒精性脂肪肝免受缺血再灌注损伤。这些研究结果表明，以AXL为靶点可能是治疗肝脏缺血再灌注损伤的一种有前途的策略，特别是对于酒精性脂肪肝的边缘肝脏供体。

实验方法

        基因和蛋白表达分析、蛋白质组学分析、Western blot、免疫组化、免疫荧光染色、细胞培养、OGD/R模型构建、细胞死亡实验、肝脏I/R模型构建、ALD模型构建、肝功能分析、组织病理学检查、透视电子显微镜

参考文献

        Fang Q, Yan Q, Liu X, Zhang X, Zha L, Zhang R, Gao Z, Du J, Chen L. Activated AXL Ameliorates Alcohol-associated Steatotic Liver Ischemia-Reperfusion Injury by Inhibiting ER stress and Mitochondria-associated Apoptosis. Int J Biol Sci. 2025 Jan 20;21(3):1294-1307. doi: 10.7150/ijbs.103789. PMID: 39897049; PMCID: PMC11781187.